复合方法制备SD大鼠动脉粥样硬化模型

张安邦，黄　昕，李令根，赵　钢

复合方法制备SD大鼠动脉粥样硬化模型

张安邦1，黄昕2，李令根2，赵钢2

目的：探索一种快速、简便建立SD大鼠动脉粥样硬化模型的方法。方法：30只雄性SD大鼠随机分成正常对照组（A组）、高脂饮食联合维生素D3组（B组）、复合方法造模组（C组）。A组喂食普通饲料，B组给予高脂饮食和维生素D3（VitD3），C组在高脂饮食的基础上给予VitD3腹腔注射、丙基硫氧嘧啶（灌胃）、免疫损伤法、FeSO4（饮水）制备大鼠动脉粥样硬化模型，实验4周后处死，光镜下观察主动脉的病理变化；检测血清总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）和低密度脂蛋白（LDL）。结果：光镜下观察，A组SD大鼠未出现动脉硬化改变，B组仅出现轻度动脉硬化病变，C组出现典型动脉粥样硬化改变；A组血清TC、TG、LDL分别为（2.82±0.26）mmol/L,（1.69±0.31）mmol/L,（1.62±0.26）mmol/L，B组分别为（3.68±0.41）mmol/L,（0.95± 0.21）mmol/L,（2.19±0.35）mmol/L，C组分别为（4.33±0.28）mmol/L,（0.99±0.13）mmol/L,（2.19±0.24）mmol/L，C组与A组比较升高显著（P＜0.01），C组与B组比较升高明显（P＜0.05）。结论：复合造模方法比高脂饮食联合VitD3成模效果好，可以快速简便造成大鼠动脉粥样硬化模型。

复合方法；SD大鼠；动脉粥样硬化模型

动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)是心脑血管疾病的主要病理基础。由于AS的发病机制复杂，应用复合方法模拟动脉硬化的病程，尽量接近人的动脉硬化病程是广大科研工作者一直在探索的方法。大鼠具有饲养方便、来源广、食性与人相近等优点，是较为理想的AS动物模型；但其主要缺点是单纯高脂饮食不易导致动脉粥样硬化。很多学者尝试应用多种方法制备大鼠动脉硬化模型，并取得了很多成绩，但仍存在造模时间长、效果不确定等缺点。本研究拟应用多种方法联合应用，尽快诱发大鼠动脉硬化，为AS的病理和药理研究奠定基础。

1　材料和方法

1.1实验动物与试剂30只体质量（250±20）g的健康SD大鼠，均为雄性，由黑龙江中医药大学动物实验中心提供，在黑龙江中医药大学动物实验室内喂养。高脂饲料配制：20%猪油、5%白糖、3%胆固醇、0.15%胆酸钠、2%蛋黄粉，69.85%的基础饲料[1]。主要试剂：VitD3注射液（大连美仑生物技术有限公司），丙基硫氧嘧啶（上海蓝季生物），牛脱氧胆酸钠(北京化学试剂公司)，胆固醇干粉(普博欣生物科技有限公司分装)，卵清白蛋白干粉，牛血清白蛋白干粉，硫酸亚铁(天津市光复科技发展有限公司)等。

1.2大鼠分组及给药30只SD大鼠随机分为3组（每组10只），正常对照组（A组）、高脂饮食联合VitD3组（B组）、复合方法造模组（C组）。适应性喂养1周后，A组继续喂食普通饲料，B组开始给予高脂饲料及VitD3腹腔注射，腹腔注射前禁食禁水8 h[2]，第一周每只大鼠一次性腹腔注射VitD360万IU/kg，第二周开始每周一次注射10万IU/kg[3]。C组采用复合方法制作动脉粥样硬化模型大鼠，即高脂饮食、VitD3腹腔注射、丙基硫氧嘧啶（灌胃）、免疫损伤法、FeSO4（加入到饮水）。丙基硫氧嘧啶按每日每只大鼠进食量的0.20%灌胃给药[2]；VitD3第一周每只大鼠一次性腹腔注射VitD360万IU/kg，第二周开始每周一次注射10万IU/kg[3]腹腔注射前禁食禁水8 h[2]；免疫刺激从造模第1周开始通过皮下注射（注射部位为背部或后肢外侧）牛血清白蛋白(40 mg/kg)，共3周(3次/周)，并腹腔注射卵清白蛋白(2.5 mg/kg)，每3 d 1次，共5次[4]；饮水中加入FeSO4(25 mg/100 mL)[4]，定期给予杂食。喂食每只每次15 g，2次/d，并观察饮水、体重、外观、活动等情况。3组大鼠共饲养5周，直至取材。

1.3标本的收集与处理各组动物分别于实验结束时用20%乌拉坦按1 g/l000 g剂量腹腔注射麻醉后将动物固定于手术台，用剪刀剪开腹腔及胸腔，经腹主动脉采血，分离血清，于黑龙江中医药大学附属第一医院检验科检测血清总胆固醇TC、TG和LDL。分离腹主动脉及胸主动脉，留取3.0 cm左右长的主动脉血管，用生理盐水轻轻冲洗后，剪取0.5 cm用4%多聚甲醛固定做光镜检查。

1.4统计学处理方法所有统计工作均在SPSS 17.0统计软件包内进行,采用t检验。

2　结果

2.1血脂水平的变化试验前3组大鼠的血清总胆固醇、甘油三脂水平差异没有显著性，而试验后模型组中的胆固醇、甘油三脂比实验前显著升高（P＜0.01）见表1。

表1　大鼠VitD3高脂模型血清TC、TG、HDL水平(mmol/L,n=10,±s)

表1　大鼠VitD3高脂模型血清TC、TG、HDL水平(mmol/L,n=10,±s)

注：与A组比较，aP＜0.05，bP＜0.01；与B组比较，cP＜0.05

组别A组B组C组TC 2.82±0.26 3.68±0.41b4.33±0.28b、cTG 1.69±0.31 0.95±0.21b0.99±0.13bLDL 1.62±0.26 2.19±0.35a2.19±0.24b、c

2.2形态学变化

2.2.1对照组无粥样斑块形成高脂饮食组无明显主动脉粥样硬化的形态改变；模型组主动脉可见明显的粥样斑块改变。

2.2.2光镜下各组大鼠主动脉动脉粥样硬化形成情况对照组主动脉平滑肌排列整齐规则，管腔内皮光滑，无增生、钙化及泡沫细胞形成，高脂饮食组仅内膜略肥厚，模型组中膜严重钙化，明显不规则增厚，有泡沫细胞形成，平滑肌纤维排列显著紊乱，内膜可见有增生。

2.2.3电镜下各组大鼠主动脉动脉粥样硬化形成情况对照组内皮完整，平滑肌纤维正常，排列紧密，胶原纤维排列规则，无增生，高脂饮食组仅内皮细胞略增生、变形，模型组胶原纤维明显增多，排列紊乱，局灶性纤维溶解变性，局部有脂质样颗粒沉积在细胞间隙中，平滑肌细胞核固缩，核染色变深，部分可见坏死的平滑肌细胞，平滑肌细胞线粒体空泡化，弹力板断裂，染色变淡，呈断续状排列，内皮细胞大部分脱落，局灶有血栓形成（大量红细胞），可见有泡沫细胞(见图1～图3)。

图1　空白对照组主动脉内膜光滑，结构正常(×200)

图2　高脂联合VD3组平滑肌纤维略紊乱(×200)

图3　复合方法造模组内膜明显增厚，大巨噬细胞、泡沫细胞和脂质浸润皮下，形成纤维帽(×100)

3　讨论

AS模型可选择动物较多，如猪、猴、家兔、鹌鹑、大鼠和小鼠等，其中家兔、基因缺陷性小鼠和大鼠应用最为广泛[2]。然而，家兔高脂饮食产生的损伤类似于黄瘤病，和人类AS有一定差别[5]而限制了它的应用。大鼠无胆囊，可通过减少肝脏合成胆固醇，增加胆汁酸生成而使血浆脂蛋白浓度保持相对稳定，使得大鼠具有抗AS特性，单纯用高脂喂养大鼠很难获得AS模型，但是作为实验动物，大鼠应用广泛、易获得、易饲养，属杂食类动物，生理解剖与人类相似，更重要的是可用于实验研究的商品抗体种类丰富[6]。因此，我们摸索建立大鼠动脉粥样硬化模型。

AS的发生是血浆中脂质沉积在动脉内膜并刺激结缔组织增生的结果。因此，大多数AS模型是建立在高脂食物基础上的，但大鼠无胆囊，对胆固醇等脂质吸收少，单纯的高脂饲料只能产生脂质沉积，很难诱导大鼠AS的形成[7]。研究表明[8-10]，喂食高脂饮食添加抑制甲状腺功能药物，可引起高脂血症及早期粥样硬化改变。大量实验与临床资料证明高脂血症是AS形成的主要危险因素[11]。成春英等[12]以高脂合剂灌胃建立Wistar大鼠高脂血症模型，发现病变多见于中、小血管，内膜不同程度增厚，管腔狭窄。有研究[4]发现通过高脂饮食和免疫损伤结合的方法能够使得低密度脂蛋白升高，同时实验结果还发现该方法建立的大鼠模型体重增大，表现出肥胖症状。胆固醇诱导AS发生的机制是喂食胆固醇可引起高脂血症，损伤血管内皮，引起动脉内皮通透性升高及血液单核细胞黏附，脂蛋白及单核细胞浸润血管内膜，在清道夫受体的介导下，单核巨噬细胞与平滑肌细胞吞噬脂质形成泡沫细胞，进而堆积成AS斑块[7-9]。

研究表明，人类动脉硬化的血管壁中含有大量的钙，其含量与冠心病的病变程度呈正相关[13]。Bennani-Kabchi等[14]发现健康冠状动脉壁钙含量处于较低的水平，而脂质条纹中钙含量增加13倍，纤维斑块钙含量则上升至24倍。晚期复合斑块中钙含量可达到正常冠状动脉的80倍，提示血管的钙化参与AS的产生和发展过程。此后许多研究[3-6,15-18]以不同剂量VitD3作为诱导剂建立动物模型，结果提示VitD3剂量过小，不易形成典型As血管病变，大剂量的VitD3可促进动脉发生钙化[19]，但剂量过大，则会造成大鼠的死亡。周红等[3]认为在造模前腹腔注射60万IU/kg，造模后第3、6、9周各补充10万IU/kg是比较有效的制备AS大鼠模型的方法，具有成功率高、死亡率低等优点，本试验遵循前人经验，运用VitD3分次给药诱导建立大鼠动脉粥样硬化模型。VitD3诱导大鼠动脉粥样硬化形成的机理Kramsch等[20]认为是VitD3有利于损伤血管内皮细胞，促进血浆脂质及钙对血管壁的侵入和沉积[21]，从而加速AS的形成。

炎症和损伤是动脉粥样硬化发病机制之一。流行病学和基础医学研究表明，AS的形成主要是血管在不同危险因子作用下的炎症反应[22-23]，AS模型动物炎症标志物发生相应的变化也证实这一点。刘剑刚等研究表明[24]免疫损伤结合高脂饮食造成动物AS，导致血浆ET-1的增加及N0水平的降低，引起细胞炎性反应，导致白细胞黏附增强。与单纯高脂饲料组比较，免疫损伤结合高脂饲料组的血管活性物质AngII水平升高显著，肾素血管紧张素系统(RAS)激活、血栓栓塞是导致AS形成和进展的重要因素[25]。因此，有学者[26]利用免疫损伤和致敏方法建立动脉粥样硬化的动物模型。

任宁[27]，韩平华等[28]研究表明，高浓度的铁离子能够加速动脉内粥样硬化斑块形成，体内铁储存量不足时可影响LDL的合成，并能减少动脉粥样硬化斑块形成，体内铁储存量高时，铁能够使动脉内有强烈的脂质过氧化作用的铁依赖性超氧自由基生成增多。超氧自由基增多可加速体内过氧化的损伤过程，同时加速了动脉粥样硬化的进程。本研究也表明，饮水补充铁离子的方法可加快大鼠AS模型建立。

由于大鼠无胆囊，单纯高脂饲料喂养不易使大鼠血清胆固醇增高，不易形成AS病变。因此很多学者在高脂饲料配方中，增加了胆酸钠和丙基硫氧嘧啶，胆酸钠能显著提高胆固醇吸收量，后者则使甲状腺功能低下，最终使TC和LDL增高，HDL降低。吴楠等[2]证明丙基硫氧嘧啶灌胃建立动脉粥样硬化大鼠模型的方法较丙基硫氧嘧啶进食的方法操作简便、模型死亡率低、建模效果可靠。故本实验采用丙基硫氧嘧啶灌胃联合其他方法建立模型。

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（收稿：2014-11-28修回：2015-03-02）

（责任编辑王 丰）

统计学方法记述要求

统计学符号一律按GB 3358-1982《统计学名词及符号》的有关规定，采用斜体排印。常用的符号有：(1)样本的算术平均数(中位数仍用M)，(2)标准差用s，(3)标准误用sx，(4)t检验用t，(5)F检验用F，(6)卡方检验用希文小写χ2，(7)相关系数用r，(8)自由度用希文小写υ，(9)概率用P。对于定量资料，应根据所采用的设计类型、资料特点和分析目的，选用合适的统计学分析方法，不应盲目套用t检验和单因素方差分析；对于定性资料，应根据所采用的设计类型、定性变量的性质和频数所具备的条件及分析目的，选用合适的统计学分析方法，不应盲目套用χ2检验。对于回归分析，应结合专业知识和散布图，选用合适的回归类型，不应盲目套用简单直线回归分析；对具有重复实验数据检验回归分析资料，不应简单化处理；对于多因素、多指标资料，要在一元分析的基础上，尽可能运用多元统计分析方法，以便对因素之间的交互作用和多指标之间的内在联系做出全面、合理的解释和评价。统计学方法的记述不能笼统记录为SPSS或SAS软件，而应写明所用统计学方法的具体名称，如：成组设计资料均数比较的t检验、两因素析因设计资料的方差分析、多个均数之间两两比较的q检验等，必要时给出统计量的具体值（如：t=4.35，χ2= 5.33，F=12.09等）；在用不等式表示P值时，一般情况下选用P＞0.05、P＜0.05和P＜0.01 3种表达方式，无须再细分。当涉及到总体参数（如总体均数、总体率等）时，在给出显著性检验结果的同时，再给出95%可信区间。

Multi-factor Methods to Establish Atherosclerosis Model in SD Rats

ZHANG An-bang,HUANG Xin,LI Ling-gen，et al.Heilongjiang University of Traditional Chinese Medicine,Haerbin（150040）,China

ObjectiveTo explore a rapid,simple method of atherosclerosis model in SD rats.Methods Thirty healthy male SD rats were randomly divided into a normal control group（A）,a high-fat diet with vita⁃min D3group（B）,and a multi-factor group（C）.Group A had basic food,group B had a high-fat diet and intra⁃peritoneal injection of VitD3,group C had high-fat diet with intraperitoneal injection of VitD3,lavage of propyl⁃thiouracil,immune damage,and FeSO4treatment.These rats were sacrificed after 4 weeks experiment to observe the pathological changes of the aorta and to detect serum total cholesterol(TC),triglyceride(TG)and low density lipoprotein.ResultsIn optical microscopy,group B had mild atherosclerosis lesions,and group C had typical atherosclerosis.Serum TC、TG and LDL of group A were correspondingly(2.82±0.26),(1.69±0.31),(1.62±0.26) mmol/L;group B were（3.68±0.41）,（0.95±0.21）,（2.19±0.35）mmol/l;and group C were（4.33±0.2）,（0.99± 0.13）,（2.19±0.24）mmol/L correspondingly values in Group C were increased significantly as compared with group A and group B.ConclusionCompared with the high-fat diet with vitamin D3,the multi-factor method is quicker and easier for induction of rat model of atherosclerosis.

Multi-factor;SD rats;atherosclerosis model

Q95-33；R543.5

A

1007-6948(2015)03-0282-04

10.3969/j.issn.1007-6948.2015.03.021

1.黑龙江中医药大学研究生学院（哈尔滨 150040）

2.黑龙江中医药大学附属第一医院（哈尔滨 150040）

黄昕，E-mail：544820318@qq.com