腐植酸生防生物有机肥对辣椒根腐病防治效果的研究

高 亮

(潍坊岛本微生物技术研究所 潍坊 261041)

辣椒根腐病(fusarium root rot)是保护地和露地栽培辣椒常见病害之一，各菜区均有发生，且一年四季都可发病，多雨季节和年份发病更为严重，常造成根系腐烂、植株枯死。该病主要是由半知菌亚门真菌蚀脉镰孢(Fusarium vasinfectum)、木贼镰孢(F. eguiseti)、串珠镰孢(F. moniliforme)、尖镰孢(F. oxysporum)侵染所致[1，2]，以蚀脉镰孢侵染为主。该病菌在土壤中可以存活10年，传播渠道主要有肥料、工具及流水传播[3]。不科学的施肥与管理会导致土传病害加剧[4]。目前，对于这种在辣椒连作、重茬栽培中难治的土传病害，尚没有找到一种特效的化学防治方法，而利用农业综合防治技术，尤其是生物防治越来越受到重视。辣椒根腐病的致病机理及防治技术研究表明，采用生防菌同腐植酸生物有机肥相结合为辣椒根腐病的防治开辟了一条新的途径。

腐植酸肥料及其衍生产品多种多样，经过近40年实践，腐植酸肥料以及衍生产品其体系最符合具生态农业发展需要[5]。以腐植酸为发酵基质，通过酵素菌的好气性高温发酵处理，在复合微生物的侵扰和菌丝作用下，以及复合酶的催化下，腐植酸被部分降解，可溶性小分子腐植酸含量显著增加，腐植酸的功能显现出来，表现出腐植酸和生物有机肥的累加效应。在该腐植酸生物有机肥基础上，增加生防菌剂可以培育出腐植酸生防生物有机肥。

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是应用广泛的生防菌，其抑制植物病原的范围很广，包括根、枝干、叶、花、果部病害，是一种理想的生防微生物[6]。放线菌尤其是链霉菌也是应用广泛的生防菌，对辣椒青枯病具有良好的防治效果[7]。木霉菌(Trchodermasp.)是一种对多种植物病原菌都有较强拮抗作用的生防菌[8]，具有生长繁殖速度快，能迅速占据应用空间，可产生抗菌素等作用[9]。

尽管国内外关于辣椒根腐病生物防治研究报道较多[10，11]，但该技术尚属起步阶段，在生产上的应用效果还不稳定。本研究将3种生防微生物菌剂和腐植酸生物有机肥相结合，制成4种腐植酸生防生物有机肥，应用到接种辣椒根腐病的土壤中，研究其对辣椒根腐病防治效果，旨在为腐植酸生物菌肥的应用和对辣椒根腐病的生物防治研究提供理论指导。

1 材料与方法

1.1 试验材料

辣椒品种为荷兰斯丁格辣椒，适合早春、秋冬季大棚、日光温室栽培。

供试腐植酸生物有机肥系山东省潍坊加潍生物科技有限公司利用酵素菌(BYM-FOOD)发酵褐煤及黑腐酸研制而成，其有效活菌总数5×107cfu/g、有机质55%、pH7.3。

所用生防菌株系潍坊岛本微生物技术研究所筛选的高效广谱拮抗性细菌、放线菌和丝状真菌，其中细菌为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，放线菌为泾阳链霉菌(Streptomyces jingyangensis)，丝状真菌为康宁木霉(Trichoderma koningii)。

辣椒根腐病病原菌取自山东省临朐县冶源镇福山村多年重茬种植辣椒的圆拱塑料大棚内病死辣椒植株鲜品，携带根际土壤。在山东省潍坊岛本微生物实验室内进行分离纯化后，经鉴定为蚀脉镰孢(Fusarium vasinfectum)。

供试土壤为山东省潍坊市奎文区二十里堡菜田，理化性状见表1。土壤消毒后，接种辣椒根腐病病原菌孢子悬浮液，保证土壤中孢子浓度维持在1×104cfu/g的浓度水平。

表1 供试土壤的理化性状Tab.1 The physical and chemical properties of tested soil

1.2 试验方法

1.2.1 腐植酸生防生物有机肥的研制

在利用酵素菌进行高温固态发酵褐煤和黑腐酸的基础上，加入生防菌剂，添加比例为1%。混合生防菌剂系枯草芽孢杆菌、泾阳链霉菌、康宁木霉按1∶1∶1比例混合，单株枯草芽孢杆菌有效活菌数≥2×109cfu/g，单株泾阳链霉菌有效活菌数≥1×109cfu/g，单株康宁木霉≥1×108cfu/g。

1.2.2 试验设计

试验于2014年3月20日至8月10日在山东省潍坊市奎文区二十里堡圆拱大棚内进行。试验设7个处理：处理1，腐植酸生物有机肥+混合生防菌剂；处理2，腐植酸生物有机肥+枯草芽孢杆菌；处理3，腐植酸生物有机肥+泾阳链霉菌；处理4，腐植酸生物有机肥+康宁木霉；处理5，腐植酸生物有机肥(不加生防菌剂)；处理6，普通生物有机肥(系作物秸秆、畜禽粪便生物发酵产品，其有效活菌数1×107cfu/g、有机质45%)；处理7(CK)，空白对照，不加腐植酸生物有机肥或普通生物有机肥，也不添加生防菌剂，以等量消毒土壤替代。试验所用的所有生物有机肥均按照土壤质量的0.2%使用，折合每667m2用量300 kg。将腐植酸生防生物有机肥施入土壤中，与土壤充分混合均匀，24

h后定植辣椒。小区面积20m2，重复3次。每小区栽植60株，选取植株大小相当的辣椒苗，每穴栽植1株，每平方米栽植3株，植株苗龄35天，5叶1心，株高14cm左右，茎粗3

mm左右。试验期间各种管理措施保持一致。病原菌接种后第20天(4月10日)开始观察记录发病情况，之后每隔20天记录1次，到8月9日，共记录7次。

试验结束时，每个小区随机选取3株活株，按20

cm×20cm×20

cm挖取土壤将辣椒植株取出来，去除掉根系上的土壤后，用无菌水冲洗根系，洗脱在无菌水中的土壤可视为根际土壤。所取土壤充分混匀，用四分法缩分至500g，可视为非根际土壤。根际土壤和非根际土壤用于测定土壤微生物数量和病原菌数量。非根际土壤用于测定土壤微生物的生物量。

1.2.3 测定方法

土壤指标分析采用常规土壤农化分析方法[12]；土壤微生物采用稀释平板计数法测定，细菌采用牛肉膏蛋白胨培养基，放线菌采用高氏一号培养基，真菌采用PDA培养基。病原菌采用刘丽云等提出的方法测定；土壤微生物生物量碳(SMBC)采用氯仿熏蒸—K2SO4提取-TOC仪测定法[13～16]；土壤微生物生物量氮(SMBN)采用氯仿熏蒸—K2SO4提取-茚三酮比色法[17]；土壤微生物生物量磷(SMBP)采用氯仿熏蒸—NaHCO3提取-过硫酸钾氧化法[18]。

辣椒病情分级参照姜飞等[19，20]的方法，将病情分成5级：0级为植株没有病害症状；1级为植株基部叶片出现轻微枯黄症状，根系出现轻微褐变；2级为植株中下部出现枯黄症状，根系出现褐变，但顶芽良好；3级为全株出现枯黄症状，根系褐变腐烂；4级为植株枯萎死亡，根系严重褐变腐烂。

病株率(%)=病株数/调查总株数×100%

病情指数=∑(各级发病数×该级代表数)/(总数×最高级代表值)×100

防治效果(%)=(对照病情指数-处理病情指数)/对照病情指数×100%

1.2.4 数据处理方法

均采用Microsoft Excel 2000进行计算和统计软件DPS6.5 Duncan法进行方差分析和检验。

2 结果与分析

2.1 腐植酸生防生物有机肥对辣椒根腐病发病率和病情指数的影响

在整个试验期间，各处理的辣椒病情指数均低于CK(图1)。在病原菌接种后第20天(4月10日)调查，处理1、处理2、处理3、处理4的病株率均为0，病情指数均为0；处理5、处理6和CK的病株率分别为1.67%、3.33%、6.67%，病情指数分别为0.3，0.8，1.7。最后一次调查(8月7日)，处理1的病情指数为15.2，比CK(39.2)低61.22%，比处理5(22.6)低32.74%，比处理6(33.4)低54.49%；处理2(18.5)分别比CK、处理5和处理6低52.80%、18.14%和44.61%；处理3(15.4)分别比C K、处理5和处理6低60.71%、31.86%和53.89%；处理4(18.7)分别比C K、处理5和处理6低52.30%、17.26%和44.01%。从防治效果(图2)可以看出，5月20日调查，处理1达到93.20%，处理2、处理3、处理4均达到86.40%。7月20日调查，处理1达到60.4%，处理2、处理3和处理4分别达到54.40%、62.00%和54.70%，均明显高于处理6和CK。可见，由枯草芽孢杆菌、泾阳链霉菌、康宁木霉3种生防菌复配成的复合生防菌与腐植酸生物有机肥相结合的腐植酸生防生物有机肥应用效果最好，明显优于普通生物有机肥和由单一生防菌制备成的腐植酸生防生物有机肥。

图2 不同处理对辣椒根腐病的防治效果Fig.2 Effect of different treatments on control ef fi ciency of pepper fusarium root rot

2.2 腐植酸生防生物有机肥对土壤微生物数量的影响

施用腐植酸生防生物有机肥对辣椒根际土壤和非根际土壤的微生物群落结构有着显著影响。从表2看出，根际土壤中细菌和放线菌数量显著增加，真菌数量和辣椒根腐病原菌蚀脉镰孢的数量有所减少。与CK相比较，处理1、处理2、处理3和处理4的细菌数量分别增加了5.77倍、4.40倍、4.16倍和3.31倍；放线菌数量分别增加了3.23倍、3.11倍、5.89倍和2.98倍；真菌数量减少了18.51%、25.63%、41.58%和9.24%；辣椒根腐病菌数量减少了6.92倍、2.18倍、3.54倍和6.42倍。处理5和处理6同CK相比较，根际土壤中细菌数量分别增加3.02倍和2.50倍；放线菌数量分别增加5.71倍和1.48倍；真菌数量，处理5比CK有所减少，而处理6与CK相当；辣椒根腐病原菌，处理5比CK减少46.19%，处理6比CK减少14.71%。非根际土壤中细菌、放线菌和辣椒根腐病原菌的变化同根际土壤相似，但真菌则明显不同于根际土壤，处理间差异显著。与CK相比较，处理1、处理2、处理3和处理4的细菌数量分别增加了6.56倍、7.49倍、6.06倍和6.53倍；放线菌数量分别增加了6.71倍、6.95倍、11.62倍和7.35倍；真菌数量分别减少了56.38%、52.43%、53.18%和1.79%；辣椒根腐病菌数量分别减少了7.46倍、2.51倍、4.43倍和4.65倍。处理5和处理6同CK比较，根际土壤中细菌数量分别增加4.79倍和3.93倍；放线菌数量分别增加10.04倍和5.27倍；真菌数量分别减少了10.32%和4.65%；辣椒根腐病原菌，处理5比CK减少56.17%，处理6比CK减少4.24%。综上，施用腐植酸生防生物有机肥对根际土壤和非根际土壤的细菌、放线菌数量均有显著增加，对真菌有不同程度的减少，对辣椒根腐病菌减少影响较大。此外，腐植酸生物有机肥比传统生物有机肥对根际土壤和非根际土壤中微生物数量的影响更加明显。

表2 不同处理对辣椒根际土壤和栽培土壤微生物数量的影响Tab.2 Effect of different treatments on microbial quantity of capsicum rhizosphere and cultivational soil

2.3 腐植酸生防生物有机肥对土壤微生物生物量的影响

在土壤肥力评价指标中，生物学指标被日益重视。其中，土壤微生物生物量碳(soil microbial biomass carbon，简称SMBC)作为生物指标已被国内外学者进行了广泛地研究[21]，它不仅是土壤碳素循环中的重要环节，同时也是土壤碳素循环的驱动力，是反映土壤微生物量大小的最重要指标。土壤微生物生物量氮(soil microbial biomass nitrogen，简称SMBN)是重要的土壤活性氮库和源，直接调节土壤氮素供给[22]。土壤微生物生物量磷(soil microbial biomass phosphorus，简称(SMBP)是重要的土壤活性磷库和源，直接调节土壤磷素供给。无论根际土壤还是非根际土壤，不同处理之间的微生物生物量碳含量均存在显著差异。从表3可以看出，各处理的根际土壤的微生物生物量碳含量为：处理1＞处理4＞处理1＞处理2＞处理3＞处理5＞处理6＞处理7(CK)，其中处理1最高，达到1146.52 mg/kg，是CK的1.56倍；处理6最低，达到864.34 mg/kg，是CK的1.17倍。4种腐植酸生防生物有机肥与CK比较，微生物生物量碳增加了250.35～409.42 mg/kg。不同处理之间的微生物生物量氮无论根际土壤还是非根际土壤也均存在显著差异，各处理的根际土壤的微生物生物量氮含量为：处理1＞处理2＞处理3＞处理4＞处理5＞处理6＞处理7(CK)，其中处理1最高，达到186.43 mg/kg，是CK的1.50倍；处理6最低，达到164.85 mg/kg，是CK的1.32倍。4种腐植酸生防生物有机肥与CK比较，微生物生物量氮增加了50.63～61.89 mg/kg。不同处理之间的微生物生物量磷无论根际土壤还是非根际土壤均存在显著差异，各处理的根际土壤的微生物生物量磷含量为：处理1＞处理2＞处理5＞处理4＞处理3＞处理6＞处理7，其中处理1最高，达到32.17 mg/kg，是CK的2.65倍；其他处理间差异不显著。4种腐植酸生防生物有机肥与CK相比较，微生物生物量磷增加了14.30～20.01 mg/kg，说明施用腐植酸生防生物有机肥更有利于增加土壤微生物的活性和数量。单独施用腐植酸生物有机肥或普通生物有机肥也能改善土壤生态环境，促进土壤微生物生长繁殖旺盛，增加土壤微生物的数量，但以腐植酸生物 有机肥效果较好。

表3 不同处理对土壤微生物生物量的影响Tab.3 Effect of different treatments on soil microbial biomass mg/kg

3 结论与讨论

辣椒根腐病是最为典型的土壤传播病害，随着近几年保护地种植面积的不断增加，轮作倒茬越来越困难，病害发生越来越重，导致辣椒产量、品种大幅度下降，已成为影响辣椒生产的一大病害。生产上通常采用化学药剂防治，但防效不稳定，且不理想[23]，生物防治逐渐成为研究热点。芽孢杆菌、链霉菌和木霉菌的生防效果已在香蕉、苹果、辣椒、黄瓜等作物上做了大量试验研究[24～28]，但总体上还是处于实验室水平，有关田间试验和推广应用的报道不多。生产上，由于受土壤环境、作物、季节、栽培方式、施肥、用药、灌水以及微生物吸附载体等因素的影响，单独试验生防菌的防治效果不稳定，影响了生防菌剂的推广和应用。将生防菌剂同生物有机肥，尤其是腐植酸生物有机肥相结合，利用其协同作用增加防效是今后研究和推广的重点。腐植酸生物有机肥除兼有腐植酸本身的改土肥田、提高肥效、增强抗逆、刺激生长和改善品质功效外，还含有丰富的有益微生物，具有一定的抑制病害的作用，同时其本身还是生防菌的良好载体。本研究将具有生防作用的枯草芽孢杆菌、泾阳链霉菌和康宁木霉与充分腐熟的腐植酸生物有机肥混合，制成腐植酸生防生物有机肥，用于辣椒生产，结果表明，腐植酸生物有机肥+混合生防菌剂、腐植酸生物有机肥+康宁木霉、腐植酸生物有机肥+泾阳链霉菌、腐植酸生物有机肥+枯草芽孢杆菌4个处理对辣椒根腐病原菌均有良好的抑制作用，显著降低了辣椒根腐病的病情指数，提高了防治效果，其中腐植酸生物有机肥+混合生防菌剂处理效果最好，防治效果达到93.2%。这可能是由于腐植酸生防生物有机肥所含有的高效拮抗生防菌在辣椒根际定植后，保护辣椒根系免受病原菌侵染，从而降低了病情指数，提高了防治效果。

土壤微生物的种类和数量与作物病害的防治效果存在一定的相关性[29，30]，通过调整土壤微生物结构和群落可以抑制土传病害。本研究结果表明，腐植酸生防生物有机肥能够显著影响土壤微生物的数量，与CK相比较，细菌和放线菌数量显著增多，而真菌数量有着不同程度的减少，辣椒根腐病原菌(蚀脉镰孢)的数量大大减少，这既有生防菌的作用，又有生物有机肥的作用，还有腐植酸的作用，亦或是“基质-载体-菌群”的复合作用，其作用机制有待于进一步研究。

土壤微生物生物量能反映出参与调控土壤中能量和养分循环以及有机物质转化对应的微生物数量，是植物生长可利用养分的重要来源[30]。本研究结果表明，辣椒施用腐植酸生防生物有机肥后，为微生物活动提供了优良的生存环境，显著增加了根际土壤和非根际土壤的细菌和放线菌的数量，不同程度地减少了真菌的数量，改善了土壤微生物群落组成，抑制了辣椒根腐病原菌的生长。腐植酸生防生物有机肥进入土壤后，有利于促进辣椒生长，增强抗逆性，提高辣椒植株的抗病性能。

[ 1 ]吕佩珂，刘文珍，段半锁，等.中国蔬菜病虫害原色图谱续集[M].内蒙古：远方出版社，1997

[ 2 ]刘丽云，刘晓林，刘志恒，等.辣椒根腐病菌生物学特性研究[J].沈阳农业大学学报，2007，38(1)：54～58

[ 3 ]景慧，王福花.辣椒根腐病的发生与防治[J].青海科技推广，2008，(1)：28～31

[ 4 ]黎宁，李华兴，朱凤娇，等.菜园土壤微生物生态特征与土壤理化性质的关系[J].应用生态学报，2006，17(2)：285～290

[ 5 ]曾宪成，李双.让腐植酸在补充和提升土壤肥力中发挥重要作用[J].腐植酸，2014，(2)：1～8

[ 6 ]杨佐忠.枯草杆菌拮抗体在植物病害生物防治中的应用[J].四川林业科技，2001，(9)：41～43

[ 7 ]龙克启，陆铮铮，吴石平，等.一种放线菌对辣椒青枯病的拮抗作用及其鉴定[J].河南农业科学，2012，41(11)：92～95

[ 8 ]王芊.木霉菌在生物防治上的应用及拮抗机制[J].黑龙江农业科学，2001，(1)：41～42

[ 9 ]宋晓研，孙彩云，陈秀兰，等.木霉生防作用机制的研究进展[J].中国农业科技导报，2006，8(6)：20～25

[ 10 ]张海秀，杜春梅.辣椒根腐病的发生及防治[J].黑龙江医药，2011，24(3)：457～459

[ 11 ]石鸿文，薛协清.大棚辣椒根腐病的防治[J].河南科技，1999，(12)：32

[ 12 ]鲍士旦 著.土壤农化分析[M].北京：中国农业出版社，2005

[ 13 ]Brookes P.C., Powlson D.S., Jenkinson D.S.. Measurement of microbial biomass phosphorus in soil. Soil Biology and Biochemistry, 1982, 113(14): 319～329

[ 14 ]Vance E.D.. An extraction method formeasuring soil microbial biomass C. Soil Biology and Biochemistry, 1987,(19): 703～707

[ 15 ]Wu J.S., Joergensen R.G.. Measurement of soilmicrobial biomass C by fumigation-extraction-anautomated procedure. Soil Biology and Biochemistry, 1990, (22): 1167～1169

[ 16 ]Wu J.S., Lin Q.M., Huang Q.Y., etc.. Soil Microbial Biomass Method and Application. Beijing: Meteorology Press, 2006

[ 17 ]Cai H., Shen R.F.. Determination of soil protease activity with medi fi ed ninhydrin colorimetry. Acta Pedologica Sinica, 2005, 42(2): 306～313

[ 18 ]Li L.Q.. Improvement of determination of Total Phosphorus in Water by Ammonium Molybdenum Spectrophotometric Method. Pollution Control Technology,2006, 19(3): 66～68

[ 19 ]姜飞，刘业霞，刘伟，等.嫁接辣椒根腐病抗性及其与苯丙烷类物质代谢的关系[J].中国蔬菜，2010，(8)：46～52

[ 20 ]刘丽娟，孙宝山.棉隆、根病灵防治菜豆根腐病及辣椒和甜椒疫病的药效试验[J].辽宁农业科学，1999，(1)：9～11

[ 21 ]蔡燕飞，廖宗文，罗洁，等.不同质地土壤抑病性和微生物特征[J].农业环境科学学报，2003，22(5)：553～556

[ 22 ]吴金水，林启美，黄巧云，等 著.土壤微生物生物量测定方法及其应用[M].北京：气象出版社，2006

[ 23 ]郭彩霞，迟晓红，秦娜.辣椒根腐病药剂防治试验[J].蔬菜，2001，(5)：23

[ 24 ]林陈强，李占飞，张慧，等.枯草芽孢杆菌CS16诱导香蕉抗病性相关防御酶系的研究[J].福建农业学报，2013，28(6)：570～574

[ 25 ]纪兆林，凌筝，张清霞，等.地衣芽孢杆菌对苹果轮纹病菌和炭疽病菌的抑制及其对贮藏期苹果轮纹病的防治作用[J].果树学报，2008，25(2)：209～214

[ 26 ]常冬梅，张志刚，尚庆茂.根际接种芽孢杆菌对辣椒和黄瓜壮苗形成的作用[J].中国蔬菜，2010，(6)：53～57

[ 27 ]张艳丽.木霉制剂和杀菌剂协同控制辣椒疫病的研究[D].浙江大学硕士研究生学位论文，2013

[ 28 ]李胜华，谷丽萍，刘可星.有机肥配施对番茄土传病害的防治及土壤微生物多样性的调控[J].植物营养与肥料学报，2009，15(4)：965～969

[ 29 ]张志红，冯宏，肖相政，等.生物肥防治香蕉枯萎病及对土壤微生物多样性的影响[J].果树学报，2010，27(4)：575～579

[ 30 ]徐华勤，章家恩，冯丽芳，等.广东省不同土地利用方式对土壤微生物量碳氮的影响[J].生态学报，2009，129(8)：4112～4118