基于石墨烯－依来铬青蓝R的新型免标记电化学免疫传感器用于CA19－9检测

于鲁平，蒋周倩，蔡小辉，林丽清，翁少煌，林新华

CA19－9是一种消化道肿瘤相关糖抗原，以唾液黏蛋白的形式存在于血清中，也分布于正常胎儿的胰腺、胆囊、肝、肠和正常成年人的胰腺、胆管上皮等处，是存在于血液中的消化道肿瘤相关抗原。正常人血清中CA19－9的临界参考值为37U／mL，如明显升高，可以指示消化道肿瘤，特别是胰腺癌，并能作为临床诊断胰腺癌的常规指标之一[1－2]。目前，临床上主要采用化学发光（CL）和电致化学发光（ECL）等方法检测 CA19－9[3－4]，但存在试剂昂贵、操作繁琐等不足。电化学免疫传感器具有灵敏度高、可操作性强的特点，是检测生物大分子的重要技术手段[5]。免标记电化学免疫传感器是新近发展的新型检测方法，通过识别生物大分子反应过程中信号响应的变化而实现目标物的检测，具有灵敏度高、操作简便、响应快速、易小型化和价格便宜等优点。近年，多种新型的信号产生方式用于免标记电化学免疫传感器的构建，比如硫堇和普鲁士蓝等信号指示体系[6－7]。本研究采用滴涂法在电极表面修饰化学法合成的氧化石墨烯（GO），然后通过电聚合制备石墨烯－依来铬青蓝R（GO－ECR）修饰电极，利用ECR表面富含的羧基通过酰胺反应将CA19－9单克隆抗体（Anti－CA19－9）固定于电极表面，根据抗体－抗原反应固定CA19－9，检测CA19－9固定前后修饰电极对铁氰化钾响应的差异，定量检测CA19－9的浓度。

1 材料与方法

1.1 仪器和试剂 电化学检测系统（Autolab PGSTAT302F，荷兰Eco Chemie公司），电化学分析仪（CHI 660C，上海辰华仪器有限公司）。采用三电极体系：工作电极为玻碳电极（GCE，直径为3mm），对电极为铂丝电极，参比电极为Ag／AgC1电极。恒温恒湿培养箱[CTHI－150B，施都凯仪器设备（上海）有限公司]；CA19－9单克隆抗体（英国Abcam公司），CA19－9标准品（日本Tosoh公司），石墨（南京先丰纳米材料科技有限公司），依来铬青蓝R（C23H15Na3O9S，上海阿拉丁试剂有限公司），1－乙基－（3－二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐（EDC）和N－羟基硫代琥珀酰亚胺钠盐（NHS）（美国Sigma－Aldrich公司）。含10mmol／L铁氰化钾电对（[Fe（CN）6]3－与[Fe（CN）6]4－的物质的量比为1∶1）的10mmol／L PBS缓冲溶液（pH 7.4，实验室自制）。所有试剂均为分析纯，实验用水为Millipore超纯水。

1.2 方法

1.2.1 GCE的处理 GCE用0.3和0.05μm氧化铝微粉依次抛光，然后依次用硝酸溶液（体积比为1∶1）、无水乙醇、去离子水超声清洗5min，超纯水清洗，N2吹干备用。

1.2.2 GO的制备 根据Hummers改进方案合成GO，控制冰浴条件下，于圆底烧瓶中小心加入浓 H2SO4∶浓 H3PO4（9∶1），之后分别加入0.5g石墨和3g KMnO4，控制冰浴条件反应3h，然后升温至35℃，氧化反应1h，继续升温至50℃，反应12h；在冰浴条件下加入67mL的冰水，滴加30%H2O2至溶液变为亮黄色，5 000r／min下离心10min，收集沉淀，分别用双蒸水和30%HCl洗涤3次，用乙醇洗至中性，在室温条件下真空干燥24h，得到干燥的GO。

1.2.3 基于 GO－ECR 活性传感界面检测 CA19－9的免标记电化学免疫传感器的构建 将20mg的GO超声分散于1mL去离子水中，并进一步稀释成0.2mg／mL的GO分散液。将5μL的GO分散液滴于处理好的GCE表面，抽干，即得GO／GCE。将GO／GCE置于ECR溶液中，控制电位范围为－0.4～1.6V，扫描速度为0.1V／s，循环伏安（CV）法扫描20圈电聚合，去离子水冲洗电极并用氮气吹干，得 ECR－GO／GCE。EDC、NHS活化ECR－GO／GCE表面的羧基，滴加1mg／mL的CA19－9抗体反应1h，并用0.1%BSA溶液封闭残留活性位点，得到Anti－CA19－9／ECR－GO／GCE。之后，将不同浓度的CA19－9标准品滴加于Anti－CA19－9／ECR－GO／GCE表面，抗原－抗体免疫反应，分别用PBS和蒸馏水冲洗电极修饰界面，除去未反应的CA19－9，最后在pH 7.4的铁氰化钾电对中进行电化学检测，对比抗原－抗体反应前后的电流信号的差异，信号变化情况用于CA19－9浓度的定量计算，如图1所示。

图1 非标记型电化学免疫传感器检测CA19－9的构建原理图Fig 1 The schematic diagram of preparation of label－free electrochemical immunosensor for the detection of CA19－9

1.2.4 血清样品的测定 血清样品由福建医科大学附属第一医院提供，应用本研究构建的方法测定血清CA19－9，对比1.2.3的测定过程，除了用血清样品代替CA19－9标准品外，其他操作保持一致，采用1.2.3的定标曲线校准得到CA19－9的浓度，并与临床ECL分析法的测定结果做对比。

2 结 果

2.1 CA19－9抗体固定的形貌表征 免疫传感器制作过程中CA19－9抗体固定前后修饰电极的形貌如图2所示。图2A为裸GCE，其表面光滑平整，出现一些电极处理过程引起的轻微划痕，也出现少量凸起。GCE修饰ECR－GO之后，电极表面呈现出粒径较小、高度起伏较小的粗糙突起（图2B）；经过EDC、NHS 活 化，在 ECR－GO／GCE 表 面 固 定CA19－9 抗 体 后，得 到 的 Anti－CA19－9／ECR－GO／GCE，其表面显著变化，出现明显的簇状突起，且突起粒径变大（图2C）。

图2 不同电极界面的AFM图Fig 2 AFM images of the surface of different modified electrodes

2.2 非标记型免疫传感器的电化学表征 非标记型免疫传感器检测CA19－9制作过程中不同修饰步骤的电化学表征图见图3。图3A为传感器制作过程不同步骤在铁氰电对溶液中的CV图。从图可以看出，GCE显示出铁氰化钾可逆的氧化还原峰（曲线a）；当在GCE表面修饰GO，得到GO／GCE，铁氰化钾的氧化还原峰电流减小（曲线b）；在GO／GCE表面聚合ECR后，得到ECR－GO／GCE，铁氰化钾的氧化还原峰电流明显减小（曲线c）；在ECR－GO／GCE上固定CA19－9抗体后，铁氰化钾的氧化还原峰电流有所增大（曲线d）；用BSA封闭抗体修饰电极（Anti－CA19－9／ECR－GO／GCE），铁氰化钾的氧化还原峰电流略微减小（曲线e）；修饰电极与CA19－9反应并固定CA19－9之后，铁氰化钾的氧化还原峰电流相对抗体修饰电极明显减小（曲线f）。CV结果证实，随着电极的逐步修饰，氧化还原电流响应逐渐变化。图3B为传感器不同修饰步骤在铁氰电对溶液中的差分脉冲伏安图（DPV），显示出铁氰化钾在电极表面变化的氧化峰。从图可以看出，DPV的铁氰化钾氧化峰电流变化规律与CV图中的氧化还原峰变化一致，但是DPV的氧化峰电流的变化比较明显。应用抗体修饰电极（曲线e）和免疫反应固定抗原的电极（曲线f）前后峰电流差值（ΔI）可以定量分析CA19－9的浓度。

2.3 传感器的特异性 在相同实验条件下，DPV检测所制备的传感器对血清中常见干扰物的响应，如图4所示，相近浓度的蛋白标志物对传感器电流响应信号的变化值明显小于CA19－9的电流信号变化，所制备的传感器能够显著区分CA19－9和其他干扰物的信号。

2.4 传感器检测CA19－9的线性关系 在最佳实验条件下，用制备的传感器测定一系列不同浓度的CA19－9。如图5所示，随着CA19－9浓度的增大，DPV的氧化峰电流逐渐减小。在0.05～500U／mL范围内，电流变化值与CA19－9浓度的对数值呈良好的线性关系（图5插图），线性回归方程如下：

相关系数R为0.995 1，根据信噪比为3计算，得到检测限为0.01U／mL。

2.5 传感器对血清样品的测定 采用制备的传感器检测5份临床血清样品中的CA19－9，并与ECL检测结果进行比较（表1）。传感器检测结果的相对标准偏差（RSD）＜10%，与ECL检测结果相对偏差的绝对值也是＜10%。

图3 不同修饰电极在[Fe（CN）6]3－／4－溶液中的电化学响应Fig 3 The electrochemical response of different modified electrodes in [Fe（CN）6 ]3－／4－solution

图4 在相同实验条件下用所制备的传感器检测浓度为5ng／mL的胰蛋白酶、CEA、PSA、AFP和5U／mL的CA125、CA153及CA19－9的直方图Fig 4 The histogram of anodic peak current responses of the immunosensor toward trypsin，CEA，PSA and AFP with concentration of 5ng／mL，CA125，CA153，and CA19－9with the concentration of 5U／mL

表1 血清样品中CA19－9的测定Tab 1 Detection results of CA19－9in five real serum samples

图5 检测不同浓度CA19－9的差分脉冲伏安图Fig 5 The differential pulse voltammetry of the immunosensor for CA19－9of different concentrations

3 讨 论

GO是通过碳六元环组成的新型二维纳米材料，表面含有大量的含氧基团，具有良好的亲水性和生物兼容性，常用于固定生物活性分子以构建新型的生物检测装置，比如电化学免疫传感器[8]。GO可通过与聚合物薄膜复合以制作电化学免疫传感器的生物识别界面，这样有利于提高敏感界面的构建并提高检测的综合性能。电化学免疫传感器是应用抗原－抗体的反应原理，结合抗原－抗体反应前后电化学响应信号的变化差异进行检测目标抗原浓度的一种传感器，具有可控、价廉以及灵敏度高的特点，被广泛用于临床蛋白质类标记物的检测[7－10]。本实验以实现快速、方便检测胰腺癌及消化道恶性肿瘤的重要标志物CA19－9为目的，建立基于GO－ECR为抗体固定敏感界面的CA19－9检测新方法。首先通过滴涂法将GO修饰于电极表面，再通过CV法聚合形成GO－ECR稳定电极修饰界面，然后采用碳二亚胺交联法共价键合固定Anti－CA19－9；根据抗原－抗体反应的特点，一定浓度的CA19－9能够特异、定比例地与抗体反应并固定在电极表面。由于CA19－9属于非导电性的蛋白质大分子，在检测溶液中对铁氰化钾离子在修饰电极表面的传递具有阻碍作用，使得电极表面固定CA19－9之后，响应电流明显降低。通过电流的降低幅度可以对CA19－9定量而实现高灵敏检测。本方法具有响应快、操作便捷的特点。

原子力显微镜是利用样品表面与微尺度力敏感元件之间的极微弱的相互作用力而实现物质表面结构及性质的表征，可以观察传感器制备过程其表面的变化。通常情况下，未做任何修饰的GCE表面光滑平整，电化学聚合制备ECR－GO修饰的GCE表面出现分布均匀，粒径为30nm左右的粗糙小突起；进一步共价键合固定CA19－9抗体以后，原先均匀的小颗粒突起转变成簇状、高度起伏较大的突起，呈现生物大分子聚集的现象，表明CA19－9抗体修饰电极表面的成功固定[11－12]，而且显著的形貌变化说明电极表面固定了足量的抗体，有利于提高检测CA19－9的灵敏度。

采用CV法和DPV法，选用铁氰化钾电对作为电化学探针对免疫传感器的制作过程及其表面的变化进行考察。对比修饰电极不同步骤在铁氰化钾电对中的CV扫描图。在GCE表面依次修饰GO和聚合ECR后，CV曲线中的氧化还原电流依次明显减小，这是由于制备的GO和聚合在GO表面ECR导电性不好[13]，对[Fe（CN）6]3－／4－在修饰电极表面的传递具有一定的阻碍作用，表明GO和ECR依次被成功地修饰于电极表面。可能是由于CA19－9抗体具有较高的等电点，在修饰电极表面固定抗体后，CA19－9抗体带正电，促进负电荷的[Fe（CN）6]3－／4－传递，CV曲线的氧化还原峰电流增大，抗体固定前后修饰电极响应电流的变化说明了抗体的固定成功。用BSA对固定抗体的修饰电极封闭，由于BSA属于非导电性的蛋白质大分子，加上BSA的等电点为4.7，在溶液中带负电，显著排斥负电性的[Fe（CN）6]3－／4－传递，使得CV曲线的氧化还原峰电流降低。一定浓度的CA19－9与修饰电极反应之后，CV曲线的氧化还原峰电流明显减小，表明检测液中的CA19－9与修饰电极表面的抗体成功进行免疫反应，形成抗原抗体对而固定在修饰电极表面。通过在[Fe（CN）6]3－／4－溶液中扫描传感器不同步骤的DPV图得到电极表面的氧化响应电流，其氧化峰电流变化趋势与CV图的氧化还原峰的变化一致，而且由于DPV的氧化峰电流值变化较明显，因此选择CA19－9与修饰电极进行免疫反应前后的氧化峰ΔI定量分析CA19－9。

免疫传感器的选择性决定了对实际血清样品中CA19－9的检测能力，需要讨论传感器的特异性。在相同实验条件下，用所制备的免疫传感器检测相似浓度的血清中常见蛋白质标志物，包括胰蛋白酶、CEA、CA125、CA153、PSA 以及 AFP，结果显示其他常见血清标志物的电流变化值明显小于相同浓度CA19－9的电流变化值，表明制备的免疫传感器具有良好的特异性和选择性，能够用于复杂体系中CA19－9的检测。在最佳实验条件下用制备的传感器测定不同浓度的CA19－9，随着CA19－9浓度增大，DPV氧化峰电流逐渐降低，且抗原抗体固定前后的ΔI逐渐增大，说明了CA19－9浓度的变化能够引起传感器响应电流的敏感变化。CA19－9浓度在0.05～500U／mL范围内，ΔI与 CA19－9浓度的对数值呈良好的线性关系，其线性方程可用于血清体系中检测CA19－9的定量分析。而且本方法检测CA19－9的检测限（0.01U／mL）较低，与现有应用纳米复合材料放大信号的三明治型电化学传感器检测CA19－9的相当[14]。应用所制备的传感器检测胰腺相关疾病的血清样品中的CA19－9，检测结果的RSD＜10%，而且检测结果与临床ECL检测结果的相对偏差的绝对值也＜10%，表明本方法检测临床血清样品中CA19－9的结果具有良好的准确度和精密度，具有较好的实用性，为用于临床检测CA19－9提供了可能。与临床ECL比较，本研究构建的基于GO－ECR的免疫传感器检测CA19－9具有操作简便、灵敏度高和成本低廉等优点，为其进一步用于临床检验提供了良好的研究基础。

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