免疫组织化学在淋巴组织疾病诊断中的应用与结果评价

赵 艳 金 鑫 李 楠 秦燕子

（蚌埠医学院第一附属医院临床病理科，1蚌埠医学院第一附属医院肿瘤外科，安徽233000）

免疫组织化学技术应用于病理诊断起始于20世纪70年代。目前此项技术已成为病理诊断中不可缺少的检测手段，特别在淋巴网状组织肿瘤的诊断、分型和鉴别诊断中，与分子遗传学技术一起成为重要的辅助手段。淋巴瘤病理诊断与鉴别诊断是临床病理诊断中的难点。我们在工作中发现，由于对临床资料，形态学特点的把握不够，免疫组化标记选择有误及结果判断的不准确，导致误诊的病例时有发生，我们通过对3例淋巴组织疾病病例临床资料，形态学特点及免疫标记结果的回顾，加强对免疫组化合理应用及正确评价其结果重要性的认识。

材料和方法

1.临床资料

收集蚌埠医学院第一附属医院临床病理科2011年6月至2012年8月疑难及误诊淋巴组织疾病3例。

例1男60岁 发现右腹股沟肿块一个月，全身其它部位未见明显肿大淋巴结。大体所见：灰红组织，5cm×4.5cm×4cm，切面质软。例2女19岁 高烧数天（＞38度）咽痛伴锁骨上淋巴结肿大。大体所见：淋巴结1枚，圆形，直径1.5cm，切面实性，质稍韧；例3男26岁 全身瘙痒10月余，发现颈部淋巴结肿大一月余，左颈部触及多枚肿大淋巴结，活动无压痛，其余部位未触及浅表淋巴结肿大。胸、腹部CT未见异常。行左颈部淋巴结活检。大体所见：淋巴结2枚，大者圆形，直径2.5cm，切面实性；小者呈结节状，直径1.0cm，切面实性质软。

2.试剂与方法

2.1 常规石蜡切片

HE染色，光学显微镜观察组织形态学特点。免疫组织化学染色：采用EnVision二步法，DAB显色。所用一抗抗体：CD20（克隆号L26）、CD79a（HM47／A9）、Pax5 （SP34）、CD10 （56C6）、bcl6（P1F6＋PG－B6p）、bcl2（8C8）、CD3（多克隆）、CD43（DF－T1）、CD30 （Ber－H2）、ALK1（5A4）、MUM1（MUM1P）、EMA（E29）等均购自福州迈新生物技术开发有限公司。

2.2 免疫组化结果判定标准

高倍镜下随机选取5个视野，每个视野观察细胞数不少于200个，按阳性细胞所占百分比及着色深浅进行评分。阳性细胞＜5%为0分，5%－25%为1分，26%－50%为2分，51%－75%为3分，＞75%为4分。无着色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。以两项评分的乘积最终判定结果：＜3分为阴性（－），3－5分为弱阳性（＋），6－9分为中度阳性（＋＋），10－12分为强阳性（＋＋＋），（＋）－（＋＋＋）均视为阳性病例。

结 果

例1组织学特点：低倍：组织周边局部区域可见清晰的境界，并有少量淋巴细胞，肿瘤在脂肪间隙弥漫浸润。其旁有一小淋巴结。高倍：瘤组织呈肉瘤样弥漫性生长，交错束状排列，由长短不一梭形和不规则形细胞构成，瘤细胞间可见少量细小胶原束（见图1）。瘤细胞显示中等异型性，核呈长短不一的梭形，偶见单个中－大圆形淋巴样细胞，核膜增厚，多数胞核呈空泡状，见1～2个小核仁或单个大核仁。易见核分裂象。胞质较丰富，细胞分界不清。其旁见一淋巴结，以中－大淋巴样细胞（中心细胞或中心母细胞），并见少量小淋巴细胞。瘤组织中夹杂极少量组织细胞。

免疫组化标记结果：

瘤细胞：阳性：Vim 1＋；CD68 2＋；Lysozyme 1＋；Ki－67 3＋ 80%－90%；CD20 2＋ （见 图 2）；CD79a2＋；Pax5 3＋；CD10 1＋；bcl－6 2＋ 阴性：CK；SMA；H－caldesmon；CD21；CD35；S－100；Desmin；HMB45；CD3；CD43；CD30；ALK－1；Mum－1；

诊断：“右腹股沟”弥漫大B细胞性淋巴瘤DLBCL，梭形细胞变异型

例2：组织学特点：低倍：滤泡不明显，局部隐约可见，大部分区域滤泡消失呈“斑驳状”，T区扩大。高倍：在斑驳状区域的小淋巴细胞中有散在大细胞（见图3），有些是组织细胞，有些有核仁，有的是单个中位核仁，有的是多个靠边核仁。T区内小血管增多，内皮细胞肿胀，间质很少，以细胞成分为主。

免疫组化标记结果：

残存滤泡：CD20＋（见图4）；CD79a＋；CD21＋；CD23＋；Ki－67 2＋40%－50%

副皮质区：CD3＋；CD43＋；大细胞：CD20，CD30不同程度＋；EMA－；ALK－

诊断：急性淋巴结T区增生

例3组织学特点：低倍：淋巴结被膜纤维化.被膜下窦残存，淋巴滤泡结构消失。淋巴结内大量胶原纤维增生并伴有片状坏死。高倍：肿瘤细胞弥漫增生，体积大，单核、双核或多核（见图5），胞质丰富淡染，核大.类圆形或马蹄形.核仁大而明显，核仁周围可见空晕，核分裂易见。多核细胞围绕形成花环状。残存的淋巴窦内可见肿瘤细胞浸润生长。背景细胞中可见少量淋巴细胞及嗜酸性粒细胞。

免疫组化标记结果：

瘤细胞：阳性：Pax－5弱＋；CD30＋（见图 6）；Ki－67 3＋约85% 阴性：LCA；CD3；CD20；CD15；CD68；CD1a；S－100；EMA；ALK；EBER染色（－）。

诊断：（左颈部）淋巴结经典型霍奇金淋巴瘤CHL，混合细胞型。

讨 论

例1的梭行细胞形态易与间叶源性肿瘤混淆。新版WHO淋巴瘤分类中，分别在DLBCL和间变性大细胞淋巴瘤的组织病理叙述时，描述了不常见的梭形细胞形态变异［1］。以结外多见，主要发生于皮肤、软组织和骨，以B细胞表型为主。其中累及骨髓的几乎是骨外间变性大细胞淋巴瘤的进展期病例。本例分析：梭形细胞变异的弥漫性大B细胞淋巴瘤（SV－DLBCL）除上述变异瘤细胞成分为主外，仔细观察有少量灶性或极少量单个散在的圆形或卵圆形中－大的瘤细胞，即中心细胞和中心母细胞特征的淋巴样细胞，尤其在靠近肿块周边或所浸润的脂肪等疏松组织中可寻找到淋巴瘤的痕迹，对拟诊SV－DLBCL很有帮助。然后再作蛋白检测和基因重排分析，可避免漏误诊。另外软组织肿瘤往往是推进性生长，肿瘤主体中不该存在脂肪组织，而本例肿瘤在脂肪间弥漫浸润，提示与软组织肉瘤的诊断不符。

鉴别诊断：（1）软组织肉瘤：由于SV－DLBCL常见于皮下及其他部位软组织中，光镜下梭形细胞为主，呈弥漫、束状排列，易误诊为梭形细胞肉瘤。单凭瘤细胞对波形蛋白标记阳性易误诊为软组织肉瘤；有时还需与梭形细胞型无色素性恶性黑色素瘤鉴别。（2）上皮性恶性肿瘤：皮下等处软组织中发生的SV－DLBCL，有可能误认为是转移的肉瘤样癌或低分化癌，需增加细胞角蛋白（CK）等上皮性抗体标记，以除外转移癌的可能。（3）其他类型的淋巴造血系统肿瘤：间变性大细胞淋巴瘤小细胞变异型，梭形细胞小，免疫表型为T／裸细胞性，其中少量大圆形免疫母样瘤细胞表达CD30和EMA阳性和（或）ALK阳性。而SV－DLBCL的梭形细胞较大，免疫表型为B细胞性；还需与罕见的交指树突细胞肉瘤／滤泡树突细胞肉瘤相鉴别，后者瘤细胞表达S－100和CD68阳性。交错树突细胞肉瘤CD21阴性，滤泡树突细胞肉瘤CD21阳性。必要时还要与更为罕见的组织细胞肉瘤相鉴别。

例2T区增生引起淋巴结结构破坏的假象以及大细胞增多，核分裂可见，T区Ki－67指数高，是特别容易误诊为T细胞淋巴瘤的病例。对于T区增生的病例CD3、CD20、CD21、Ki－67是4个非常重要的免疫组化标记。CD21包括CD23、CD35可以标记隐藏的树状突细胞网，看这个网的数量和分布、大小可以判断淋巴结是不是被破坏。淋巴瘤往往整个或部分淋巴结的结构破坏。而一般增生生发中心的细胞虽然看不清但这个网还在。CD3，CD20是目前标T，B细胞最特异的抗体，可观察T，B细胞的分布情况。Ki－67提示细胞的生长速度，有些病变看起来很凶，如果增殖指数很低也不一定考虑是肿瘤，淋巴瘤可分为高、中和低度恶性，当确定是淋巴瘤后，通过增殖指数可以大致判断肿瘤的类型。如果指数在50%以上，提示是高度恶性。

急性淋巴结T区增生的诊断病史很重要［2］，这些病例往往病史很短，起病急，高热、淋巴结肿大，一般不超过一个月。可有接种史或用抗精神药物史。抗生素治疗无效。虽酷似淋巴瘤，但整个病变很新鲜，即以细胞成分为主，没有明显纤维间质和基质。大细胞CD20和CD30常常是强、中、弱表达，还有阴性细胞，提示这些细胞处于分化的不同阶段，CD30阳性细胞不成片，不像间变性大细胞淋巴瘤的广泛强阳性。小血管增生，腔内可见中到大的活化母细胞；病毒或血清学病毒抗体检测，往往提示病毒感染。

鉴别诊断：（1）间变性大细胞淋巴瘤：往往也见于儿童和年轻人，起病急伴高热和淋巴结肿大，T区增宽，不同亚型中瘤细胞多少不同。但CD30往往成片强阳性，阳性细胞可在淋巴窦内或围绕血管生长，不表达CD20，可表达ALK、EMA、T细胞和细胞毒性抗原。（2）霍奇金淋巴瘤：大细胞CD30阳性外还表达CD15，CD20阳性细胞数量少，Pax5往往弱阳。

例3大家对CHL形态学认识通常为淋巴结结构部分或完全破坏，在背景细胞中散在分布体积较大的单核、双核或多核细胞。可见典型的RS细胞。偶见肿瘤细胞在淋巴窦内生长。对于肿瘤细胞丰富.呈片状生长模式（即所谓的“富于肿瘤细胞型”CHL）认识不足［3］。CHL起源于生发中心B细胞，仅40%病例可表达CD20且强度变化大，阳性细胞数量少。CD79a很少阳性，Pax5往往弱阳。几乎所有HRS细胞CD30阳性，75%－85%呈CD15阳性。本例形态学上的片状大细胞与ALCL相似，免疫组织化学染色在二者鉴别诊断中具有重要意义。ALCL来源于外周成熟T淋巴细胞，但多数T细胞抗原通常丢失，甚至可以表现为无任何T细胞抗原表达的“裸细胞型”。因此常规使用的T、B淋巴细胞标志物以及CD30对于两种疾病的鉴别诊断意义不大。必须选用Pax5、EMA、ALK、CD45等鉴别。同时EBV检测也有意义。CHL可有EB病毒感染而ALCL往往EBV阴性。

鉴别诊断还应包括：间变型弥漫大B细胞淋巴瘤、组织细胞肉瘤、浆细胞瘤、转移癌和恶性黑色素瘤。上述肿瘤均以大细胞呈片状或弥漫性生长为特点.免疫标志Pax5均为阴性，结合相应抗体如CD20、CD68、CD138、CK、S－100和 MelanA 等可鉴别。

通过对以上3例免疫组化标记的回顾，我们发现淋巴瘤的诊断一定要建立在对组织形态学正确把握的基础上。同时抗体的选择至关重要。实际应用中免疫抗体可分为一线、二线与三线抗体［4］。一线抗体CD45（LCA）、vimentin、NSE及CK等可将肿瘤大致归类，是淋巴瘤、肉瘤、神经内分泌肿瘤或未分化癌等。二线抗体T、B淋巴细胞、组织细胞、R－S细胞标记抗体等进行淋巴瘤分型。对于形态学有交叉的淋巴瘤应增用三线抗体。如ALCL应用CD30、ALK、EMA抗体，套细胞淋巴瘤加用cyclinDl、CD5，区别淋巴母细胞与小细胞淋巴瘤用TdT抗体。为了弥补淋巴瘤抗体特异性与敏感性不一存在交叉反应的问题最好同类抗体配伍使用。如T 标记用 CD45RO、CD3，B 标记用 CD20、CD79a，组织细胞标记用 CD68、Mac387，Langerhans细胞标记用S－100蛋白、CDla这样配合应起到互补性作用。

例2中谈到观察免疫组化结果时，不能只看阳性阴性，还应注意阳性的真假，定位是否准确，阳性的细胞是否真正的肿瘤细胞，以及阳性的强弱，量变及分布形式等。如T细胞淋巴瘤常伴有炎性多形背景，可有小淋巴细胞，浆细胞或组织细胞等，某些淋巴瘤还可有残留正常淋巴组织。阳性细胞判断的失误会导致误诊的发生。多数T、B淋巴瘤、组织细胞肉瘤，其T或B、组织细胞阳性标记瘤细胞优势，呈弥漫分布，而反应性少量阳性B、T、组织细胞呈散在或岛状（残留）、小片状分布。但也有CD3与CD20在T或B淋巴瘤同时呈优势阳性，这是由于二者交叉反应或是双标记淋巴瘤所致。有时T、B标记均不满意，我们只能以HE瘤细胞特点或较特异的抗体来确定类型。如瘤细胞胞质红染、有浆样分化、泡状核、核仁明显者定为B细胞淋巴瘤，胞质色淡透明，核形不规则，核膜不清，核仁小或无者则定为T细胞淋巴瘤。

同时一定要知道免疫组化也可能出现的特殊情况。例1中如果没考虑到淋巴瘤仅Vim阳性很容易武断地放在未分化肉瘤里。其实不仅Vim阳性，CK或EMA阳性都不能否定淋巴瘤的诊断。国内外已有许多报道［5－6］，CK 阳性的 NHL或淋巴瘤出现CK阳性的间质网状细胞。而且不是所有淋巴瘤细胞CD45（LCA）均阳性。实际上CD45只是大多数T与B细胞淋巴瘤细胞阳性，不能因CD45阴性就完全排除淋巴瘤的可能。淋巴瘤分型标记亦是相对性而非绝对可靠指标。由于淋巴瘤细胞处于分化或转化的不同阶段，在其早期阶段可以是非T非B或双向性。另外目前所用标记抗体均不是100%特异，T与B有交叉反应。免疫组化分型用克隆性基因重排检测对照并非完全一致。

由此可见，病理组织学改变才是免疫组化结果评价的基础。由于免疫组化结果易受到多种技术性与人为因素以及抗体特异性与敏感性不足的影响，其结果始终是HE组织学改变的辅助与补充，不能脱离组织学改变去评价免疫组化的结果。要做出正确的诊断，除形态学及免疫组化外还要结合临床资料必要时辅以分子遗传学检测，在思路上即要“证实”也要“证否”，考虑周全，才能减少失误的发生。

［1］王军臣 施达仁 符雪莲.弥漫性大B细胞淋巴瘤梭形细胞变异二例.中华病理学杂志，2005（34）1：55－56

［2］周小鸽.提高对急性T区增生性病变的认识.中华病理学杂志，2007，（36）2：73－75

［3］Tamaru J，Tokuhira M，Nittsu N，et a1.Hodgkin－like anaplastic large cell lymmphoma（previously designated in the REAL classification）has same immunophenotypic features to classical Hodgkin lymphoma. Leuk Lymphema，2007，48：1127－1138

［4］朱梅刚，林汉良.淋巴瘤病例诊断图谱.广州：广东科技出版社，2010，24－8

［5］Ponzoni M，Ferreri AJ，Campo E，et al.Definition，diagnosis，and management of intravascular large B－cell lymphoma：6.proposals and perspectives form an international consensus meeting.J Clin Oncol，2007，25：3168－3173

［6］Ferreri AJ，Dognini GP，Campo E，et al.Variations in clinical presentation，frequency of hemophagocytosis and clinical behavior of intravascular lymphoma diagnosed in different geographical regions.Haematologica，2007，92：486－492

图 版 说 明

图1 弥漫大B细胞性淋巴瘤的梭形瘤细胞×400

图2 梭形瘤细胞表达CD20×400

图3 副皮质区小淋巴细胞中有散在大细胞×400

图4 CD20大细胞的强中弱及少量阴性表达×400

图5 肿瘤细胞体积大，单核、双核或多核×400

图6 肿瘤细胞表达CD30×400

EXPLANATION OF FIGURES

Fig.1The spindle tumor cells of Diffuse large B cell lymphoma×400

Fig.2The expression of CD20in the neoplastic spindle cells×400

Fig.3There are some large cells scattered in small lymphocytes at Deputy cortex ×400

Fig.4CD20large cells of strong，weak and small amount of negative expression×400

Fig.5The volume of tumor cell is big，mononuclear、dinuclear or multicore×400

Fig.6The expression of CD30in tumor cells×400