跑步锻炼对抑郁症模型大鼠大脑白质及白质内有髓神经纤维影响的体视学研究

王飞飞 谭川雪 陈林木 高 原 黄春霞 周春妮 蒋林 张毅 晁凤蕾 张蕾 唐勇＊

（1重庆医科大学基础医学院组织胚胎学教研室，2干细胞与组织工程研究室，3生理学教研室，4附属第一医院老年科，重庆400016）

抑郁症是一种以心境低落为主要特征的严重精神疾病，且发病率逐年上升，抑郁症发病机制与治疗一直受到国内外研究者的广泛关注。目前临床药物治疗虽然可以有效的改善抑郁症患者症状，但停药后复发率高，并且存在一定局限性和明显的副作用［1］，因此，非药物治疗手段在抗抑郁症中日益得到重视。以往研究表明，锻炼可以改善并消除人们的不良情绪［2］。大量临床研究已经观察到锻炼对抑郁症有治疗作用。对于轻中度抑郁患者，锻炼可以达到抑郁药物同等的治疗效果［3，4］。而基于大鼠抑郁症模型的研究也发现，锻炼可有效改善抑郁样行为［5］，虽然已有临床研究及动物实验研究均表明锻炼对抑郁症有治疗作用，但是锻炼治疗抑郁症的机制尚不清楚。

目前，越来越多的研究观察到，脑白质改变与抑郁症密切相关，抑郁症患者表现出大脑白质及白质内神经纤维完整性的异常改变［6］。许多研究通过弥散张量成像（diffusion tensor imaging，DTI）等影像学手段都发现抑郁症患者大脑某些区域的白质纤维束的FA值低于正常人，而FA值能够较好的评估组织结构的完整性和连通性，FA值的降低表明白质的完整性及白质纤维的连贯性都有一定程度的破坏［7－8］。可能由于这种结构的破坏造成了神经系统信号传导的异常，从而产生情绪障碍等精神神经症状。Scholz等用影像学手段研究发现有氧运动可以有效保护白质内神经纤维素的完整性［9］，而我们团队前期研究也发现短期跑步锻炼能够增加中老年及老年大鼠大脑白质体积和有髓神经纤维总长度［10］，然而跑步锻炼可否影响抑郁症大鼠大脑白质有髓神经纤维的改变尚未见报道。因此，本实验以SD大鼠为研究对象，探讨跑步锻炼对慢性不可预见性应激所致抑郁症模型大鼠的行为学、大脑白质及白质内有髓神经纤维的影响。

材料和方法

1.实验动物

雄性SD大鼠，体质量（200±20）g，由重庆医科大学实验动物中心提供。将大鼠置于室温22±1℃、12h／12h昼夜交替环境中适应性喂养1w后，用旷场试验筛选出评分接近的40只大鼠［11］。

2.动物分组及CUS模型制备

将大鼠随机分为2组：空白对照组（10只）、抑郁模型组（30只）。空白对照组大鼠每5只一笼，正常进食进水；抑郁模型组以 Willner等［11］的建模方法为基础并加以改进，制备大鼠CUS模型，大鼠均单笼饲养并给予大鼠慢性不可预见性应激，每天随机安排一种刺激，保证同种刺激不连续出现，建立模型的刺激方式包括以下11种：禁食24h、禁水24h、噪音1h（80分贝）、潮湿垫料24h、限制活动1h、鼠笼倾斜45°24h、4℃冷水浴5min、45℃热水浴5 min、夹尾1min、通宵照明、电击足底5min（电流强度1.0－1.5mA）。上述刺激持续四周，每种刺激出现2－3次。应激结束后，根据行为学结果［12］，选取抑郁成模大鼠20只，随机等分为模型对照组和模型跑步组，空白对照组不作任何处理。

3.跑步干预

模型跑步组于第5w开始给予为期四周的跑步干预（图1），将大鼠置于水平跑台上进行规律的跑步锻 炼，速 度：20m／min，时间：20min／d，5d／week。跑步第1w为适应期，速度从10m／min逐渐加速到20m／min，第2w开始持续以20m／min跑步［13］。

4.体质量测定

在建模开始第1d和每周糖水消耗试验前分别测定3组大鼠的体质量，每周1次。

5.行为学试验

5.1 糖水偏好试验

禁食禁水24h后，同时提供给实验大鼠1%蔗糖水和纯水各1瓶，24h后通过测量蔗糖水和纯水的消耗量，计算糖水偏好百分比（糖水消耗／总液体消耗×100%），期间大鼠单笼饲养，正常进食。糖水偏好试验每周进行一次［11］。

5.2 旷场试验

定制100cm×100cm×40cm敞箱，敞箱底部平均分成25个格子，并安装有自动摄像设备。试验时保持周围环境安静，将大鼠置于中央方格，自动记录大鼠5分钟的活动情况。试验结束后分析录像，记录水平得分（四爪均进入方格可计1次穿格）及垂直得分（两前爪抬高1cm以上可计1次），于第四周和第8w 进行［14］。

5.3 强迫游泳试验

定制直径20cm，高50cm圆柱形透明有机容器，水温23－25℃，水深以大鼠尾尖部刚好触及不到容器底部为宜。第1d对各组大鼠进行15min强迫游泳训练，第2d进行5min的强迫游泳测试，记录大鼠静止不动时间，于第四周和第八周最后两天进行［15］。

6.标本的固定与取材

1%戊巴比妥钠（4ml／kg）腹腔注射麻醉大鼠后，开胸经心脏灌注固定，先用70ml生理盐水（加肝素）冲洗大鼠体内血液，再用4%的多聚甲醛液进行固定，灌注流速为18ml／min。开颅将大脑完整取出，随机抽取一侧半脑，沿冠状方向切成1mm厚的连续脑片，并用解剖显微镜对脑片枕侧面放大10倍拍照。每组随机选取5只动物，按等距随机的方法在含有白质的连续脑片中抽取四张，随机叠加等距测点，在测点与白质重叠处取1mm3大小的组织块，每只动物抽取4块。

7.电镜标本制作

将抽取的白质组织块浸泡在4%的戊二醛中，置于4℃冰箱固定2h，用0.1mol／L PBS（pH 7.2）冲洗三次后进行2h锇酸染色，同样置于4℃冰箱中。逐步经50%、70%、90%的乙醇，90%乙醇与90%丙酮混合液及100%丙酮溶液梯度脱水，最后浸泡在100%环氧树脂内。为了确保白质内有髓神经纤维在每个方向上被抽取的概率均相同，我们采用球切法（Isector）将浸透好的白质块包埋成直径为5mm的树脂小球，而后将小球用常规电镜包埋的方法进行再次包埋［16］。从每个包埋好的组织块中随机切取一张60nm厚的超薄切片，经透射电子显微镜放大6200倍后拍下随机抽取的8个视野，每只动物有32张电镜照片。

8.体视学分析

8.1 白质总体积

将等距测点叠加在解剖显微镜照片上，计数在一侧半球白质上的测试点数∑P（wm）（图2），根据卡瓦列原理［16］计算出白质总体积：

V（wm）为白质总体积，t为切片厚度（1mm），a（p）为每个测试点对应的面积（0.18mm2）。

8.2 白质内有髓神经纤维长度密度与总长度

将面积为108μm2的无偏计数框叠加在电镜照片上，按照计数原则（禁线法原则）计数无偏计数框内有髓神经纤维断面数（图3），根据下列公式［16－17］分别计算白质内有髓神经纤维长度密度和有髓神经纤维总长度：

L（nf／wm）为白质内有髓神经纤维长度密度，∑Q（nf）为计数的有髓神经纤维断面总数，∑A（frame）为所使用的无偏计数框的总面积，L（nf，wm）为白质内有髓神经纤维总长度，V（wm）为白质总体积。

9.统计学处理

实验数据以 Mean±SD表示，采用SPSS19.0对数据进行统计分析，运用Student’s t－test、单因素方差分析和非参数检验方法，比较各组之间数据的差异，以P＜0.05为差异具有统计学意义。

图1 给予大鼠跑步锻炼干预Fig.1Rats run on the murine treadmill machine.

图2 解剖显微镜照片（×10），计数落在白质上的测试点数Fig.2The anatomy microscope image（×10）.The number of the points hitting the white matter are counted.

图3 透射电镜照片（×6200），计数白质内有髓神经纤维断面数Fig.3The transmission electron microscope image（×6200）.An illustration of the method to count the number of the myelinated fiber profiles in the white matter is shown.

结 果

1.大鼠体质量的改变

实验开始前两组大鼠体质量一致，从应激第二周开始，抑郁模型组大鼠（20只）体质量显著低于空白对照组（10只）（P＜0.05），而四周应激结束时，此差异最为明显。后四周的跑步锻炼期间，模型对照组和模型跑步组大鼠体质量均显著低于空白对照组（P＜0.05），但模型跑步组大鼠体质量与模型对照组相比并未出现统计学差异（P＞0.05，图4）。

图4 大鼠体质量变化趋势a：P＜0.05，b：P＜0.01，与空白对照组相比Fig.4The change trend of rat weighta：P＜0.05，b：P＜0.01，compared with control group

图5 大鼠糖水偏好试验中糖水偏好百分比的比较a：P＜0.05，b：P＜0.01，与空白对照组相比；c：P＜0.05，与模型对照组相比Fig.5The comparisons of preference of sucrose are shown.a：P＜0.05，b：P＜0.01，compared with control group；c：P＜0.05，compared with control depression group.

2.大鼠糖水偏好试验结果

第4w抑郁模型组在糖水消耗试验中糖水偏好百分比［（76.86±8.16）%］明显低于空白对照组［（94.50±3.24）%］（P＜0.01）；在接受四周跑步锻炼后，对此改变有明显逆转作用，模型跑步组糖水偏好百分比［（91.49±4.83）%］较模型对照组［（79.70±13.32）%］显著升高（P＜0.05），同时与空白对照组［（91.48±6.17）%］相比无统计学差异（P＞0.05，图5）。

3.大鼠旷场试验结果的改变

在第4w的旷场试验中，CUS导致抑郁模型组总评分（74.95±42.85）显著低于空白对照组（150.40±29.90）（P＜0.01）；第8w时，模型跑步组大鼠总评分（113.90±27.59）有增加趋势，但与模型对照组（87.40±43.79）相比并无统计学差异（P＞0.05，图6）

图6 大鼠旷场试验总评分的比较a：P＜0.05，与空白对照组相比Fig.6The comparison of the results of open－field test a：P＜0.05，compared with control group.

4.大鼠强迫游泳试验结果的改变

在第4w的强迫游泳试验中，抑郁模型组大鼠不动时间（152.95±39.48）显著高于空白对照组（112.70±36.75）（P＜0.05）；跑步锻炼4w 后，模型跑步组（大鼠不动时间144.40±59.11）有所降低，与模型对照组（184.30±46.21）相比较无统计学差异（P＞0.05，图7）。

5.体视学结果

抑郁模型组大鼠大脑白质总体积（77.15±11.08）和有髓神经纤维总长度（53.70±1.94）均显著低于空白对照组（89.46±4.15、115.69±37.19）（P＜0.01、P＜0.01）；经过4w的跑步锻炼后，模型跑步组大鼠大脑白质体积（87.68±7.49）和有髓神经纤维总长度（74.96±8.27）与模型对照组相比均显著增加（P＜0.05）；与空白对照组相比，模型跑步组大鼠大脑白质总体积无显著性差异（P＞0.05），白质内有髓神经纤维总长度显著性降低（P＜0.05，图8）。myelinated fibers in the white matter

图7 大鼠强迫游泳试验中不动时间的比较a：P＜0.05，与空白对照组相比Fig.7The comparison of the immobility time in the forced swimminga：P＜0.05，compared with control group.

图8 大鼠大脑白质总体积及白质内有髓神经纤维总长度的比较a：P＜0.01，与空白对照组相比；b：P＜0.05，与模型对照组相比Fig.8Stereological results of the white matter and the a：P＜0.05，compared with control group；b：P＜0.05，compared with control depression group.

讨 论

目前，用来研究抑郁症的模型种类很多，本实验采用慢性、不可预见性刺激模拟人类生活中应激事件的方式建立大鼠CUS抑郁症模型［11］，主要用糖水偏好试验检验模型是否成功，是目前最常用的有效评价抑郁大鼠快感缺乏的行为学检测手段［18］。本实验中应激第四周的行为学检测结果表明，应激大鼠体重、糖水偏好百分比、旷场总评分较非应激大鼠降低，强迫游泳不动时间较非应激大鼠增加，出现一系列的抑郁样行为，与以往研究结果一致［12］，提示该模型建立成功，成模率为66.7%。

目前，临床上对抑郁症的治疗主要以药物治疗为主，虽然有一定的治疗效果，但副作用大，存在个体差异，那么如何选择一种安全有效的治疗抑郁症的方法尤为重要。而跑步锻炼作为一种简单易行的行为学干预手段已经应用于许多疾病的治疗中，Greist等人［19］首次研究了跑步锻炼对抑郁症的治疗作用，后续研究也同样认为跑步锻炼有利于抑郁症的康复［20－21］。有研究人员认为，被动的跑步锻炼更加接近人类锻炼的特征［22］。因此，在本实验中，采用被动跑台对大鼠进行规律的跑步锻炼干预，经过四周跑步锻炼后，模型跑步组的大鼠糖水偏好百分比显著性提高，并达到正常水平，表明跑步锻炼可有效改善快感缺失的表现，而快感缺失是抑郁症的核心症状，所以本实验结果表明跑步锻炼对抑郁症大鼠起到一定的治疗作用，与以往研究结果一致［22］。

以往基于MRI或DTI等临床影像学手段的研究中发现，抑郁症患者存在大脑白质的改变，表现出某些区域白质FA值较正常人低，提示抑郁症患者白质出现了有髓神经纤维完整性的异常［6－8，23］。神经纤维是白质的主要组成成分，对神经元之间冲动的传递起重要作用，一旦有髓神经纤维完整性破坏就会导致皮层间环路连接受损，从而引起情绪变化。Alexopoulos等首次通过DTI研究大脑白质的改变与患者抑郁行为相关性，他们发现抑郁症治疗是否有效与额区白质FA值的改变有密切关联。不过以前这些对抑郁症白质的研究主要集中在影像学领域，影像学方法不能观察到白质内有髓神经纤维的具体变化，这种定性观察结果是间接的，并受多种因素影响。以往对有氧运动对大脑作用的研究中发现，有氧运动可以有效提高老年大脑的认知功能，增加老年大脑白质体积，减少大脑白质内有髓神经纤维完整性的破坏［25－26］。既然锻炼对大脑白质有积极的保护作用，那么跑步锻炼是否是通过保护抑郁症大鼠大脑白质来改善抑郁症状的呢？为此，本实验运用透射电子显微镜技术结合无偏体视学方法精确地定量研究了抑郁症模型大鼠大脑白质体积、白质内有髓神经纤维总长度的改变以及跑步干预对其改变的影响。我们研究发现，慢性应激4w后的抑郁症模型大鼠大脑白质体积及白质内有髓神经纤维总长度均较空白对照组显著性降低，此结果更加准确的反映出抑郁症大鼠存在大脑白质内有髓神经纤维完整性破坏。同时经过4w的跑步干预后其白质总体积以及白质内有髓神经纤维总长度显著性增加。这些研究结果表明，跑步锻炼对抑郁大鼠大脑白质及白质内有髓神经纤维有积极的保护作用。

本研究首次运用新的体视学方法研究了抑郁症大鼠大脑白质及白质内有髓神经纤维的改变以及跑步锻炼对这些改变的作用，本实验的研究方法为以后的同类研究提供了很好的研究手段。本文的研究结果表明，大脑白质及白质内有髓神经纤维改变在抑郁症发病中起着重要作用，跑步锻炼能有效地治疗抑郁症，跑步锻炼对抑郁症大鼠白质内有髓神经纤维的保护作用很可能是跑步锻炼治疗抑郁症的重要结构基础之一。

［1］杨淑茵.抗抑郁药临床不良反应警示.中国实用医药，2008，3（22）：167－168.

［2］Deslandes A，Moraes H，Ferreira C，et al.Exercise and Mental Health：Many Reasons to Move.Neuropsychobiology，2009，59：19－198.

［3］Dunn AL，Trlvedi M.H，O＇Neal H.Physical activity dose－response effects on outcomes of depression and anxiety.Med Sci Sports Exerc，2001，33（6）：587－597.

［4］Brosse AL，Sheets ES，Lett HS，et al.Exercise and the treatment of clinical depression in adults：recent findings and future directions.Sports Med，2002，32：741－760.

［5］Hang Zheng，Yanyou Liu，Wei Li，et al.Beneficial effects of exercise and its molecular mechanisms on depression in rats.Behav Brain Res，2006，168（1）：47－55.

［6］Tham MW，Woon PS，Sum MY，et al.White matter abnormalities in major depression：Evidence from postmortem，neuroimaging and genetic studies.J Affect Disord，2011，132（1－2）：26－36.

［7］Colloby SJ，Firbank MJ，Thomas AJ，et al.White matter changes in late－life depression：a diffusion tensor imaging study.J Affect Disord，2011，135（1－3）：216－220.

［8］Dalby RB，Frandsen J，Chakravarty MM，et al.Depression severity is correlated to the integrity of white matter fiber tracts in late－onset major depression.Psychiatry Res，2010，184（1）：38－48.

［9］Scholz J，Klein MC，Behrens TE，et al.Training induces changes in white matter architecture.Nat Neurosci，2009，12（11）：1370－1.

［10］李琛.大鼠大脑白质有髓神经纤维老年性改变机制的探讨及短期跑步锻炼对其的作用.重庆：重庆医科大学，2010.

［11］Willner P.Validity，reliability and utility of the chronic mild stress model of depression：a 10－year review and evaluation.Psychopharmacology（Berl），1997，134（4）：319－329.

［12］Bielajew C，Konkle ATM，Merali Z.The effects of chronic mild stress on male Sprague－Dawley and Long Evans rats.Behav Brain Res，2002，136：583－592.

［13］Stranahan AM，Khalil D，Gould E.Running induces widespread structural alterations in the hippocampus and entorhinal cortex.Hippocampus，2007，17（11）：1017－1022.

［14］Liu D，Qiu HM，Fei HZ，et al.Histone acetylation and expression of mono－aminergic transmitters synthetases involved in CUS－induced depressive rats.Exp Biol Med，2014，239（3）：330－336.

［15］Makino M，Kitano Y，Komiyama C，et al.Human interferon－a increases immobility in the forced swimming test in rats.Psychopharmacology，2000，148：106－110

［16］Tang Y，Nyengaard JR.A stereological method for estimating the total length and size of myelin fibers in human brain white matter.J Neurosci Meth，1997，73（2）：193－200.

［17］Tang Y，Nyengaard JR..Pakkenberg B，et al.Age－induced white matter change in the human brain：A stereological investigation.Neurobiol Aging，1997，18（6）：609－615.

［18］Willner P，Towell A，Sampson D，et al.Reduction of sucrose preference by chronic unpredictable mild stress，and its restoration by a tricyclic antidepressant.Psychopharmacology，1987，93：358－364.

［19］Greist JH，Klein MH，Eischens RR，et al.Running as treatment for depression.Compr Psychiatry，1979，20（1）：41－54.

［20］Benjamin NG，Teresa EF，Dan B ，et al.The consequences of uncontrollable stress are sensitive to duration of prior wheel running.Brain Res，2005，1033（2）：164－178.

［21］Ensari I，Motl RW，Pilutti LA.Exercise training improves depressive symptoms in people with multiple sclerosis：Results of a meta－analysis.J Psychosom Res，2014 ，76（6）：465－471

［22］Leasure JL，Jones M.Forced and voluntary exercise differentially affect brain and behavior.Neuroscience，2008，156（3）：456－465

［23］Li W，Muftuler LT ，Chen G，et al.Effects of the coexistence of late－life depression and mild cognitive impairment on white matter microstructure.Neurol Sci.，2014，338（1－2）：46－56.

［24］Alexopoulos GS，Kiosses DN，Charit K，et al.Frontal white matter microstructure and treatment response of late－life depression：apreliminary study.Am J Psychiatry，2002，159：1929－1932.

［25］Colcombe SJ，Erickson KI，Scalf PE，et al.Aerobic exercise training increasea brain volume in aging humans.J Gerontol A Biol Sci Med Sci，2006，61（11）：1166－1170.

［26］Marks BL，Madden DJ，Bucur B，et al.Role of aerobic fitness and aging on cerebral white matter integrity.Ann N Y Acad Sci，2007，1097：171－174.