兔煤工尘肺模型各期HRCT表现与血清TNF-α、PDGF表达水平相关研究

陈强，张永林，刘岚，麦卫平

（山西医科大学第二医院影像科，山西 太原 030001）

兔煤工尘肺模型各期HRCT表现与血清TNF-α、PDGF表达水平相关研究

陈强，张永林，刘岚，麦卫平

（山西医科大学第二医院影像科，山西 太原 030001）

目的：探讨兔煤工尘肺模型在HRCT上的影像表现与肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、血小板源性生长因子（PDGF）表达水平的相关性。方法：复制兔煤工尘肺模型，分别于2周、1、2、3、5个月时对兔行HRCT扫描，同时采用酶联免疫吸附法（ELISA）检测兔血清TNF-α、PDGF含量。结果：煤工尘肺模型兔肺HRCT早期主要表现为磨玻璃影及小叶间隔增厚，中期主要表现为局限性肺间质纤维化及小蜂窝状影像，晚期主要表现为结节影、广泛环状影及实变影；试验组兔血清TNF-α含量低于对照组，差异有统计学意义（P<0.05），PDGF含量高于对照组，差异有统计学意义（P<0.05），且随时间的延长，TNF-α、PDGF水平均逐渐降低；两变量相关性分析显示TNF-α与PDGF呈正相关（P<0.05），TNF-α、PDGF含量变化与兔煤尘肺模型HRCT表现严重程度之间呈负相关（P<0.05）。结论：煤工尘肺高分辨力CT表现与TNF-α、PDGF表达水平密切相关，TNF-α、PDGF在肺组织不可逆纤维化过程中均发挥重要作用。

尘肺；模型，动物；体层摄影术，X线计算机，血小板源性生长因子；肿瘤坏死因子α；酶联免疫吸附测定

煤工尘肺是由于煤矿工人长期吸入煤粉尘且粉尘在肺内阻留引起的一种慢性疾病，以肺组织弥漫性纤维化为主要表现，对接触煤尘者危害严重，且尚无有效的治疗手段。本研究通过复制无创伤性兔煤工尘肺模型，从影像学表现和细胞因子2个方面，采用HRCT重建和酶联免疫吸附法（ELISA），探讨煤工尘肺的HRCT表现与肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、血小板源性生长因子（PDGF）表达水平的相关性。

1 材料与方法

1.1一般材料

1.1.1实验动物选用日本大耳白兔40只，均为雄性，体质量1.5～2.5 kg（由山西医科大学实验动物中心提供），检疫1周后用于实验。

1.1.2主要器材新生儿喉镜，片长70～90 cm；导管直径0.3 cm，长14 cm；导丝长10 cm。所用试剂盒均购于上海西塘生物科技有限公司。

1.1.3煤尘悬液制备取太原东山煤矿提供的煤尘样品，经球磨机充分研磨水选，制备成直径<5 μm占95%以上且游离SiO2含量<8%的煤粉尘颗粒，以生理盐水配成100 mg/mL煤尘悬液，高压灭菌后备用。

1.1.4药物配置4%戊巴比妥钠溶液配制方法：4.0 g戊巴比妥钠，溶于100 mL蒸馏水，用量1 mL/kg体质量。青霉素粉针剂160万U/支，每只20万U/d。

1.2仪器与方法

1.2.1动物分组和兔煤工尘肺模型的建立①动物分组：按随机分配原则，将40只健康雄性日本大耳白兔，随机分为2周组、1个月组、2个月组、3个月组、5个月组5组各8只，每组任选5只作为煤尘组，另外3只作为对照组。②制作模型：将实验兔用4%戊巴比妥钠麻醉后仰卧固定于实验台上，从口腔轻柔插入新生儿喉镜，尽量将兔颈项向上提直，使声带最大程度暴露，观察清楚声带后，插入附导丝的气管导管（导管进入气管后兔出现轻咳），判定导管插入气管正确后，立即将导管末端接上浓度为100 mg/mL煤粉尘的注射器，灌注量2 mL/kg，灌注成功后，即拔出导管和喉镜，轻揉双肺使粉尘自然进入各支气管。同时，为预防感染影响实验结果，造模前后3 d，注射青霉素20万U/只。按照上述实验方法，对照组兔注入同等剂量的0.9%氯化钠注射液。

1.2.2CT扫描所有白兔造模前及后各期行胸部CT扫描。采用美国GE lightspeed 16螺旋CT机，扫描范围从肺尖至肋膈角。兔麻醉、固定在固定板上、待呼吸平稳，全身肌肉松弛后开始扫描。扫描参数：120 kV，100 mA，FOV 10 mm×10 mm，螺距0.938，矩阵512×512，骨算法重建。所有图像均在GE ADW 4.1工作站上进行后处理和分析；窗宽1 300 HU，窗位-600 HU。肺间质纤维化不同严重程度的HRCT分级［1］：轻度肺纤维化改变为小叶间隔增厚和小叶内结构增粗；中度肺纤维化改变为局限性小蜂窝状影像；重度肺纤维化改变为肺内广泛环状影像或合并有实变。

1.2.3细胞因子标本采集与检测：2周、1、2、3、5个月时，经兔耳缘静脉采血后，用ELISA法统一检测血清TNF-α、PDGF含量。

1.3统计学处理采用SPSS 20.0软件进行数据分析，2组间均数比较采用独立样本t检验；试验组各分期比较采用方差分析，其两两比较采用q检验；相关分析采用Spearman秩相关分析，煤尘组HRCT表现比较采用秩和检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1煤尘组及对照组兔子不同时期HRCT表现（表1）对照组兔肺各期HRCT表现：各期兔肺纹理清晰，走行自然，未见异常密度影（图1）。煤尘组兔肺2周时：主要为肺内密度稍高影，边界模糊，呈磨玻璃密度改变（图2）；1个月：表现为磨玻璃影增多，小叶间隔增厚出现（图3）；2个月：纤维化影像增多，支气管血管束周围常常伴有纤维增生、水肿及炎性渗出等（图4）；3个月：病变进一步发展，可见煤结节形成累及胸膜（图5），部分可呈蜂窝状改变。5个月：病变晚期，肺组织纤维化加重，细支气管扩张，广泛蜂窝影像形成（图6）。

煤尘组各期HRCT的表现，差异有统计学意义（H=10.397，P<0.05）。

表1 各期煤尘组和对照组兔肺HRCT表现只

2.2煤尘组与对照组兔血清TNF-α、PDGF含量比较煤尘组兔血清TNF-α含量低于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）；PDGF含量高于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）（表2）。

表2 煤尘组和对照组血清TNF-α、PDGF含量比较（pg/mL，±s）

表2 煤尘组和对照组血清TNF-α、PDGF含量比较（pg/mL，±s）

注：TNF-α，肿瘤坏死因子；PDGF，血小板源性生长因子。

组别例数TNF-αPDGF煤尘组2551.40±1.421 771.86±139.03对照组1568.57±7.231 585.79±187.73 t值11.6023.589 P值＜0.05＜0.05

2.3各期煤尘组兔血清TNF-α、PDGF含量比较煤尘组兔血清TNF-α含量随着时间的延长而降低（P< 0.05）；PDGF含量随分期的增加而降低（P<0.05）（表3）。

2.4兔血清TNF-α、PDGF含量的相关性分析兔血清TNF-α与PDGF含量的相关性分析，TNF-α与 PDGF含量呈正相关（r=0.402，P<0.05）。

2.5兔血清TNF-α、PDGF含量与兔肺间质纤维化HRCT表现严重程度相关性分析煤尘组兔血清TNF-α、PDGF含量与肺间质纤维化严重程度呈负相关（前者r=-0.54，P<0.05；后者r=-0.37，P<0.05）。

表3 各期煤尘组和对照组血清TNF-α、PDGF含量比较（pg/mL，±s）

表3 各期煤尘组和对照组血清TNF-α、PDGF含量比较（pg/mL，±s）

注：与对照组比较，*P＜0.05；与2周时比较，▲P＜0.05；与1月时比较，■P＜0.05。

组别例数TNF-αPDGF煤尘组2周589.74±11.83*1 917.72±208.62*1个月578.57±8.74*1 809.18±202.14*▲2个月561.54±10.18*▲1 730.78±189.26*▲3个月544.96±5.65*▲■1 710.11±237.67*▲■5个月520.35±3.50*▲■1 691.52±176.42*▲■对照组1568.57±7.231 585.79±187.73 F值43.2877.925 P值＜0.05＜0.05

3 讨论

煤工尘肺的发病机制至今尚不完全清楚，其发生发展过程与多种肺间质纤维化有关的细胞因子密切相关，而HRCT能很好显示肺的细微结构，是目前检查肺间质性疾病的最佳方法［2］。本研究目的是通过复制兔煤工尘肺模型，探讨其HRCT表现与TNF-α、PDGF表达水平之间的相关性，为煤工尘肺的早期诊断及治疗提供可靠的信息。

TNF-α是具有多种生物学效应的细胞因子，其主要由单核-巨噬细胞分泌，通过激活及活化中性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞等多类细胞，参与煤工尘肺的免疫反应过程。国内外诸多实验均已证实煤尘可诱发TNF-αmRNA的表达增强，促使肺泡巨噬细胞和单核细胞中TNF-α的大量释放［3-5］，其中其308位点G→A的突变是造成人体TNF-α表达量差异的重要因素，其基因多态性引起mRNA活性蛋白表达水平的改变，进而影响煤工尘肺发生发展过程。TNF-α基因308位点Arg/Arg、Gln/Arg、Gln/Arg+Arg/Arg基因型携带者易患煤工尘肺［6-7］。PDGF是在血小板中发现的二聚体蛋白，能刺激间叶来源的细胞分裂生长，是Fb的有丝分裂原。Fb所表达的PDGF-BB主要以滞留形式存在，可对其毗邻细胞发生作用和促进自分泌［8-9］。PDGF在启动纤维化的过程中，对巨噬细胞、中性粒细胞等具有趋化作用，可刺激成纤维细胞增生，影响细胞外基质代谢，参与肺纤维化的形成过程［10］。因此，PDGF一方面通过促使上皮细胞和成纤维细胞发生有丝分裂从而促进细胞的增殖和分化，另一方面还可以通过抑制胶原纤维的降解来发挥促纤维化作用［11］。Lou等［12］认为TNF-α能诱导血小板和嗜酸性粒细胞在肺内聚集，激活的血小板可进一步释放促纤维化细胞因子，如PDGF、TGF-β1。本研究显示试验组早期兔血清TNF-α、PDGF含量均高于对照组，TNF-α与PDGF含量呈正相关，与上述研究结论一致。

图1对照组兔：肺纹理清晰，走形自然图2～6均为煤尘组兔图22周：双肺可见到磨玻璃影、斑片影图31个月：右肺可见到膜玻璃影，左肺见到呈不规则状的特征性纤维条索影图42个月：左肺见到支气管血管影走形异常图53个月：右肺多发纤维条索影，牵拉周围结构，左肺见数个结节图65个月：右肺可见多发蜂窝影，肺内结构紊乱

接触粉尘的早期，机体对粉尘刺激敏感而发生强烈的应激反应，肺泡巨噬细胞、成纤维细胞及内皮细胞过度激活［13］，产生过量的细胞因子TNF-α、PDGF等，造成肺组织损伤和发生纤维化；随着接触粉尘时间延长，机体对粉尘耐受性增高，产生细胞因子的细胞活性减低，进而细胞因子分泌减少；煤工尘肺晚期，由于沉积的胶原纤维收缩压迫肺组织［14］，上述细胞及其分泌因子减少。本研究显示，煤尘组兔血清TNF-α、PDGF含量2周时最高，随着时间的延长而降低，差异有统计学意义（P<0.05），与上述结论一致。

本研究兔煤工尘肺模型在2周时血清TNF-α、PDGF含量最高，且随时间延长逐渐降低，兔肺HRCT表现主要以磨玻璃影为主，部分出现小叶间隔增厚，呈轻度肺纤维化。1至2个月期间，TNF-α、PDGF含量逐渐减少，HRCT上以局限性肺间质纤维化及小蜂窝状影为主要表现，呈中度肺纤维化；3个月后，TNF-α、PDGF含量继续减少，HRCT以广泛蜂窝影、煤结节影及实变影为主要表现，呈中-重度肺纤维化。笔者认为临床检测TNF-α、PDGF含量早期升高后期降低时，肺组织纤维化不可逆的过程启动。

综上所述，TNF-α、PDGF是煤工尘肺发生、发展中的2项重要的免疫指标，与HRCT表现有密切关系，且TNF-α和PDGF在煤工尘肺的早期高表达，可作为煤工尘肺早期预警的血清学指标。

［1］关砚生，马大庆，贺文，等．煤工尘肺间质纤维化的高分辨率CT表现及病理基础［J］.中国医学影像技术，1998，16（5）：302-304.

［2］陈忠，顾元凯，袁晨华.MDCT对煤工尘肺的诊断价值［J］.华北煤炭医学院报，2010，12（2）：165-166.

［3］李娟，郝小惠，范雪云，等.尘肺患者血清肿瘤坏死因子、白细胞介素-6表达水平及意义［J］.中国职业医学，2012，39（3）：245-246.

［4］Piguet PF，Collart MA，Grau GE，et al.Requirement of tumornecrosis factor for development of silicainduced pumonary fibrosis［J］.Nature，1990，344：245-247.

［5］周建华.石棉诱导AM因子对成纤维细胞作用的研究［J］.工业卫生与职业病，1997，23（4）：215-218.

［6］Fan Hongmin，Zhuo Wang，Feng Fumin，et al.Association of TNF-α-238G/A and 308 G/A gene polymorphisms with pulmonary tuberculosis among patients with coal worker’s pneumoconiosis［J］. Biomed Environ Sci，2010，23：137-145.

［7］李举，黄婵，郭嘉昒，等.肿瘤坏死因子-α308位点多态性与尘肺易感的Meta分析［J］.现代预防医学，2013，40（2）：217-221.

［8］周伟琳，蔡卫民，丁永祥.血小板衍生生长因子与肝纤维化［J］.浙江大学学报：医学版，2000，29（6）：283-286.

［9］闫国和，艾国平.血小板源性生长因子与组织修复［J］.中国康复理论与实践，2007，13（1）：39-41.

［10］陈兴年，莫星帆，刘杰.矽肺患者血清TGF-β1和PDGF蛋白的检测及临床意义［J］.临床肺科杂志，2010，15（7）：945-947.

［11］GulumianM，Borm PJ，Vallyathan V，et al Mechanistically identified suitable biomarkers of exposure，effect，and susceptibility for silicosis and coalworkers’pneumoconiosis：a comprehensive review［J］.J Toxicol Environ Health B Crit Rev，2006，9：357-95.

［12］Lou J，Donati YR，Juillard P，et al.Platelets play an important role in TNF-induced microvascular endothelial cell pathology［J］. Am J Pathol，1997，151：1397-1405.

［13］李庆，李廷，祁新兰.煤工尘肺患者血清TNF-α、sIL-2R、IL26和IL28检测的意义［J］.中国工业医学杂志，2006，19（1）：11-12.

［14］邱坚卫.石工矽肺的X射线探讨［J］.中国职业医学，2005，32（3）：51-52.

Association of the HRCT features and expression of serum TNF-α、PDGF in the rabbits model of coal worker's pneu-moconiosis

CHEN Qiang，ZHANG Yonglin，LIU Lan，MAI Weiping.Department of Radiology，Second Hospital of Shanxi Medical

University，Taiyuan，030001，China.

Objective:To investigate the association of the HRCT features and expression of serum TNF-α and PDGF in the rabbits model of coal worker's pneumoconiosis（CWP）.Methods：Copying the CWP rabbit model，at 2 weeks and month of 1，2，3，5，CT scan was performed in each group，meanwhile，levels of TNF-α and PDGF in serum were measured by ELISA test. Results：HRCT features in the CWP rabbits model showed that ground-glass opacities and thick interlobular septa were observed in the early stage，pulmonary fibrosis and small honeycomb imaging were found in the middle stage，nodules、extensive ring shadow and opacities were discovered in the late stage.The level of TNF-α in serum of CWP rabbits was lower，but the level of PDGF was higher in comparison with those of the control（P<0.05，respectively）.Moreover，with the pulmonary lesions aggravating，serum TNF-α and PDGF decreased gradually.TNF-α expression level was positively related to PDGF（P<0.05）.TNF-α、PDGF expression levels were negatively related to the severity of pulmonary interstitial fibrosis（P<0.05）.Conclusion:The expression levels of TNF-α and PDGF in serum maybe related to the severity of pulmonary interstitial fibrosis，TNF-α and PDGF play an important role.

Pneumoconiosis；Model，animals；Tomography，X-ray computed；Platelet-derived growth factor；Tumor necrosis factoralpha；Enzyme-linked immuno-sorbent assay

2015-00-00）

10.3969/j.issn.1672-0512.2015.06.008

张永林，E-mail：zyl3212008@sina.com。