加味乌梅丸抑制非肥胖糖尿病／重症联合免疫缺陷小鼠胰腺癌移植瘤的蛋白组学研究

赵伟鹏，姜 欣，黄金昶

（1．北京中医药大学，北京 100029；2．中日友好医院中西医结合肿瘤内科，北京 100029）

胰腺癌是一种消化系统常见的恶性肿瘤，其发病率和病死率呈逐年上升趋势。本课题组运用加味乌梅丸治疗胰腺癌近20年，临床疗效较为理想［1］。前期动物实验证实，加味乌梅丸可以抑制裸鼠移植瘤生长，并诱导肿瘤细胞凋亡［2］。但是，加味乌梅丸抗肿瘤作用的分子机制还不完全清楚，其作用靶点的蛋白组学研究还未进行。本研究在之前研究基础上直接从蛋白质整体水平入手，初步研究加味乌梅丸对非肥胖糖尿病（non－obese diabetes，NOD）／重症联 合 免 疫 缺 陷 （severe combined immune deficiency，SCID）小鼠胰腺癌移植瘤组织蛋白表达谱的影响，旨在从蛋白组学水平研究该药抗胰腺癌的分子生物学机制。

1 实验材料

①细胞株SW1990：购自中国医学科学院肿瘤医院肿瘤细胞库，复苏后接种于培养瓶中，在含10%小牛血清的RPMI 1640培养液内常规传代培养。②SPF级NOD／SCID小鼠，雄性，3～4周龄，体质量（20±2）g，共20只，购自维通利华。购回后在中日友好医院临床研究所SPF级动物室普食饲养。③加味乌梅丸（乌梅50g，白芍、生黄芪、壁虎各30g，当归20g，桂枝、黄柏、党参、干姜、制附子、炒枳壳、木香各10g，川椒6g，细辛、黄连各3g，等）：中药饮片购自北京华邈中药工程技术开发中心，由中日友好医院药学部制备，常规水煎，水浴浓缩至生药含量2．0g／mL，4℃ 保存备用。④Q Exactive质谱 仪：Thermo Scientific 公 司。iTRAQTMReagents：AB Sciex公司，批号 A4115。⑤高效液相系统：戴安NCS3500系统，德国赛默飞世尔公司生产。

2 方法

2．1 NOD／SCID小鼠移植瘤模型复制 人胰腺癌SW1990细胞株在含10%小牛血清的RPMI 1640培养液，37℃、5%CO2细胞培养箱内培养扩增，取对数生长期的5×107／mL细胞制成单细胞悬液，取0．1mL接种于裸鼠右侧腋窝皮下，在SPF环境饲养下观察。成瘤率＝瘤体积直径大于5mm的小鼠数／该实验组的小鼠数×100%。

2．2 分组给药 在小鼠移植瘤皮下可触及，肿瘤直径增大至0．5cm时，将荷瘤小鼠随机分成对照组（n＝10）和加味乌梅丸组（n＝10）。分组后加味乌梅丸组每日灌胃给予生药40g／kg。对照组每日给予无菌注射用水0．4mL。每组灌胃容积均为0．4 mL。

2．3 肿瘤蛋白提取 给药20d后处死小鼠，剥离瘤体，将样品分别在加入液氮的研钵中研磨至极细粉末状，将样品转移至新的1．5mL离心管，按照10 mL／g加入 RIPA提取液（配方：150mmol／L NaCl，1%NP40，0．5%DOC，0．1%SDS，50mmol／L Tris，使用前加入蛋白酶抑制剂），冰上裂解30min，每5min轻轻振荡混匀。离心（4℃，14 000r／min）15min，上清转移至新的离心管。上清液即提取的全蛋白。使用BCA法对提取的蛋白进行蛋白浓度测定。

2．4 iTRAQ标记 根据BCA检测结果，每个样品取蛋白100μg于一个1．5mL离心管中，样品加入8mol／L尿素（含0．1%SDS）和超纯水（含0．1%SDS），加入9μL 500mmol／L TEAB。按 AB Sciex公司iTRAQTM试剂盒（目录号4390812）说明书进行样品处理和标记。混合标记后的样品用于强阳离子柱分级。

2．5 强阳离子柱样品分级

2．5．1 强阳离子交换色谱缓冲液 ①A：5mmol／L KH2PO4（pH 2．55），20% 乙 腈，H3PO4。②B：5 mmol／L KH2PO4（pH 2．75），20%乙腈，600mmol／L KCl，H3PO4。

2．5．2 色谱柱平衡 参照高效液相色谱仪（型号Agilent 1260）使用规程进行操作。强阳离子交换色谱柱（5μm，200孔，孔径2．1mm，长100mm，美国PolyLC）使用前用100%A平衡25min。运行多肽测试品确认仪器和色谱柱状态良好。标记样品取300μL用A液稀释7倍，用磷酸调pH值至2．5，离心，取上清上样。收集上样流出液体。

2．5．3 梯度洗脱 洗脱梯度设置如下：0%～5%B，3min；5% ～20%B，18min；20% ～30%B，6min；30%～100%B，6min。检测波长214nm，高效液相色谱图见图1。用1．5mL离心管每分钟收集一个组分。

根据色谱图合并连续的多肽含量较少的样品，共形成20个组分。使用C18离心柱对每个样品进行脱盐处理。真空抽干。

2．6 质谱检测 将样品用上样缓冲液充分溶解后上样到液质联用仪，使用C18柱（2μm，100孔，孔径75 μm，长25cm，美国Dionex）对多肽进行分离。液相色谱A相为99．9%水、0．1%甲酸。B相为99．9%乙腈、0．1%甲酸。液相色谱洗脱条件见表1。

表1 液相色谱洗脱梯度参数

质谱检测的参数设置如下：质谱仪为Q－Exac－tive，离子源电压2．3kV，离子传输管温度270℃，采集模式为数据依赖模式，质谱全扫描范围质荷比为350～1 800，分辨率为70 000。全扫描中选择离子强度前20位的母离子进行二级质谱鉴定，二级扫描分辨率为17 500。母离子使用高能碰撞诱导解离（higher energy collision dissociation，HCD）法 碎裂，进行二级质谱序列测定，同时用报告离子的比例定量。

2．7 数据分析 质谱检测原始文件使用Proteome Discoverer 1．4软件的Sequest搜索引擎与NCBI网站（http：／／www．ncbi．nlm．nih．gov）的 Human Refseq蛋白数据库（71 465个蛋白，2014年3月3日更新）进行搜索。参数设置如下：母离子允许误差范围20ppm，子离子允许误差范围0．02Da，可变修饰为Oxidation（Met），固定修饰为carbamidomethyl（Cys）和iTRAQ8plex（Any N－Terminus，Lys），胰酶酶切，允许一个漏切位点。

3 结果

从质谱结果看，在1%错误发现率（false discovery rate，FDR）的条件下，共鉴定和定量了3 741种蛋白。鉴定多肽种类数为23 450。差异分析结果表明，与对照组比较，两组样品中共有50个蛋白质点表达相差1．5倍以上。进一步筛选标准为鉴定unique peptides两条以上且定量次数≥3。共得到鉴定明确、差异显著的蛋白12个，其中10个下调（见表2），2个上调（见表3）。选取其中典型蛋白（8号蛋白）多肽1、2、3进行鉴定，分别见图2、图3、图4。

表2 表达下调最显著的10个蛋白

表3 表达上调最显著的2个蛋白

4 讨论

加味乌梅丸为温肝阳、祛寒邪、理气活血方剂，前期临床观察［1］发现，服用加味乌梅丸能很快改善患者的临床症状，尤其对胰腺癌患者的疼痛、食欲下降改善较明显，使不能行放射治疗、化学治疗的胰腺癌患者临床获益71．43%，生存期得到延长。而前期的动物实验［2］也证实加味乌梅丸可以抑制裸鼠移植瘤生长，并诱导肿瘤细胞凋亡。本实验利用蛋白组学从整体角度分析细胞内动态变化的蛋白质组分、表达水平与修饰状态。共得到12差异蛋白点，其中包括：细胞骨架相关蛋白、代谢相关蛋白、硒结合蛋白、酶类物质等。其中一些差异蛋白与肿瘤发生、发展关系密切，且被较多地研究。

其中8号和9号点均为肌球蛋白轻链。肌球蛋白作为一种超家族蛋白质，是细胞骨架的重要组成部分，通过各种调节因子对其轻链磷酸化和去磷酸化进行调节，在肿瘤细胞的增殖、侵袭和迁移中发挥重要作用。肌球蛋白轻链的磷酸化是肿瘤细胞增殖的必要条件，实验研究证实肌球蛋白轻链激酶（myosin light－chain kinase，MLCK）促使乳腺癌细胞增殖、转移，而其抑制剂处理的肝癌、结肠癌、胰腺癌、前列腺癌及乳腺癌细胞生长受抑制、数目增长缓慢，增殖受影响［3］。张孝林等［4］实验研究发现，白藜芦醇通过下调肝组织MLCK的表达水平诱导凋亡，抑制大鼠肝肿瘤细胞的增生。9号蛋白是肌球蛋白轻链骨骼肌型，8号蛋白为调节性肌球蛋白轻链2（myosin light chain 2，MLC2），磷酸化 MLC2能调节肌动蛋白细胞骨架的稳定性。沈传陆［5］用酵母双杂交方法发现MLC2是癌蛋白TRE17的结合蛋白，而TRE17癌基因在多种恶性肿瘤如平衡肌肉瘤、横纹肌肉瘤、骨肉瘤、前列腺癌、乳癌、肾癌和膀胱癌中异常表达。毫无疑问，MLC为MLCK的作用底物，用药组极有可能通过下调MLC及MLC2，进而抑制肌球蛋白调节性轻链的磷酸化，影响肿瘤细胞的迁移和侵袭。

7号和10号点均为脂肪酸结合蛋白（fatty acidbinding protein，FABP），7 号 点 为 脂 肪 细 胞 型FABP（fatty acid binding protein 4，adipocyte，AFABP），10号点为心脏型 FABP（fatty acid binding protein，heart，H－FABP），FABP是一组运输长链脂肪酸的低分子量胞浆蛋白超家族，其各成员均具有组织特异性。研究报道FABP在基因水平和组织中表达的变化，与许多肿瘤的发生、发展、转移有关。推测FABP在细胞的有丝分裂中起重要作用，从而影响肿瘤细胞的增殖。现在对于FABP与恶性肿瘤关系的研究主要集中在乳腺癌、泌尿系恶性肿瘤及肝癌上。李华等［6］认为FABP是乳腺组织中脂肪酸转运、储存和能量代谢的关键因子。在肿瘤细胞，FABP不但可转运长链脂肪酸为细胞生长提供能量及原材料，还可结合和转运各种配体，参与肿瘤生长相关的信号传导通路。其通过研究发现表皮型FABP（fatty acid binding protein 5，epidermal，EFABP）、H－FABP和肝脏型FABP（fatty acid binding protein 1，liver，L－FABP）在浸润性导管癌较良性纤维腺瘤表达明显上调，推测它们与浸润性导管癌的发生发展有关。临床研究发现L－FABP在肝细胞癌癌组织中的表达显著高于慢性乙型肝炎肝组织，提示FABP可能在肝细胞癌变中起着一定作用［7］。而在膀胱癌的研究中却发现在侵袭性膀胱癌中，A－FABP的表达显著下降［8］。而本研究中所鉴定出的两种FABP与胰腺癌的关系尚不清楚，这也将是本课题组下一步工作的重点。

2号蛋白为肌酸激酶（creatine kinase，CK）M型，CK通常存在于动物的心脏、骨骼肌及脑组织的细胞浆和线粒体中，是一个与细胞内能量转运、肌肉收缩、ATP的再生有直接关系的重要激酶。自1979年首次发现前列腺癌患者血清中CK的含量显著升高以来，在其他许多类型的癌症患者中也发现各型CK的含量显著升高［9］，近期研究更是发现CK肌肉型B（creatine kinase，muscle b，CKMB）显著升高，且CKMB／CK倒置多倾向于考虑恶性肿瘤可能性大［10］。而通过筛选CK抑制剂寻找新的抗肿瘤药物成为肿瘤研究一大热点。药物组显著下调CK－M表达，很可能也是它非常重要的抑瘤通路。

6号蛋白为碳酸酐酶（carbonic anhydrase，CA）3，CA是一族含锌酶，广泛存在于哺乳动物体内。CA在许多种恶性肿瘤中都有过表达，在不同肿瘤中表达的CA同工酶不同，在肿瘤发生、发展、侵袭和转移等过程中发挥很重要的作用［11］。Dai等［12］的研究发现，CA3通过黏着斑激酶（focal adhesion kinase，FAK）信号途径促进肝癌细胞SK－Hep1的转移和侵犯，而siRNA沉默CA3表达则可降低SK－Hep1细胞的侵袭能力，并认为其机制为过表达的CAⅢ改变了细胞内、细胞外的pH值，进而激活了FAK信号通路。马兵等［13］的研究则发现CA抑制剂托毗酯可明显减少荷瘤小鼠肺中的转移灶数，最高转移抑制率达81．25%。

本实验中用药组显著上调的蛋白是硒结合蛋白家族成员，硒是人体和动物必需的微量元素，不能自行合成，是谷胱甘肽过氧化物酶、磷脂氢过氧化物酶等数种酶的必要成分。目前，已知25个人类基因编码硒蛋白（selenoprotein）［14］，具有抗肿瘤、延缓衰老，抑制细胞分裂及肿瘤生长，促进肿瘤细胞分化，逆转恶性表型的作用。硒蛋白的表达对生存至关重要，虽然不同硒蛋白功能各异，其生化基础主要是硒蛋白的氧化还原活性。大量的研究表明血液中硒的含量过低会增加癌症的患病机率［15］，补硒治疗可以降低总体患者的病死率。硒蛋白抗肿瘤作用可能与其通过降低体内过氧化物的积累、增强机体的免疫调节能力等预防肿瘤有关［16］。

本实验中上调的2号蛋白为非组蛋白染色体蛋白（non－histone chromosomal protein）高泳动率组分（high mobility group，HMG－17）。HMG 蛋白是一种广泛存在于真核生物染色质内的非组蛋白，因其相对分子质量小，在聚丙烯酞胺凝胶电泳中迁移较快而得名。HMG蛋白由HMGA、HMGB和HMGN这三大家族组成。HMGN是一组与核小体结合的核蛋白，它在DNA损伤的染色质改变中起着重要作用，它们能够改变染色质的结构，增强染色质模板的转录和复制，而DNA损伤是肿瘤形成和发展的主要因素。研究发现，HMGN2基因位于与多种肿瘤发生有关的染色体1p区域，1p区域具有多个瘤抑制基因，1p36这一区域的染色体异常与多种肿瘤的发生有关，HMG－17基因恰恰定位于1p36．1，提示该分子很可能与抵抗肿瘤生成有关［17］。淋巴因子激活的杀伤细胞（lymphokine activated killer，LAK）是指由白介素－2激活的、具有杀肿瘤活性的NK和T细胞，目前被认为是机体抗瘤细胞系统和抗胞内微生物感染的主要免疫细胞群体，LAK细胞也是临床生物治疗恶性肿瘤最为重要的细胞。LAK细胞抗瘤和抗微生物感染的效应分子具有多样性，华西医学中心感染免疫研究室从人外周血分离培养的LAK细胞的酸溶性提取物中，筛选获得一种能抗革兰阴性菌的免疫活性肽分子，经鉴定该肽分子是 HMG－17［18］。 即HMG－17作为LAK细胞的一种效应因子而发挥抗肿瘤的活性。刘西茜等［19］通过动物实验证实HMGN2蛋白可以明显抑制人舌癌裸鼠移植瘤的生长。综上所述，HMGN2蛋白可以增强染色质模板的转录和复制，作为具有较强抗肿瘤活性的LAK细胞的一种效应因子，这些都是其抗肿瘤的重要机制。由此推测，加味乌梅丸上调HMGN2蛋白的表达是其抗肿瘤机制中极为重要的一个。

从上述数据分析来看，加味乌梅丸的抑瘤是多靶点、多效应的，其中最主要的为 MLC2、A－FABP、CA3、硒结合蛋白、HMG－17，这些很可能是其发挥抗肿瘤活性的最主要靶点，这为研制抗胰腺癌药物提供了重要的思路。这些差异蛋白的筛选、验证，所涉及的通路及相互之间的作用关系是本课题组下一步研究的重点。

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