超声预处理对玉米蛋白可酶解性的影响

金 建 马海乐 曲文娟 周存山 罗 敏 何荣海 洪 晨 翁龙梅

（江苏大学食品与生物工程学院江苏省农产品物理加工重点实验室，镇江 212013）

超声预处理对玉米蛋白可酶解性的影响

金 建 马海乐 曲文娟 周存山 罗 敏 何荣海 洪 晨 翁龙梅

（江苏大学食品与生物工程学院江苏省农产品物理加工重点实验室，镇江 212013）

旨在采用超声预处理改善玉米蛋白的酶解性，研究了超声频率模式（单频、双频、定频和扫频）及频率参数对玉米蛋白酶解水解度及溶解率的影响，采用高效尺寸排阻色谱法对酶解液的分子质量分布进行了表征。研究发现，（68±2）kHz／（28±2）kHz双频扫频为最佳超声频率模式，优化试验获得超声预处理的最佳工作参数为：超声温度30℃、料液比1∶20（g／mL）、超声处理时间40 min、扫频周期500 ms、超声功率密度80W／L、脉冲超声的工作时间10 s和间歇时间3 s。在最佳超声频率模式及工作参数预处理的条件下，水解度和蛋白溶解率分别为23.6%和75.2%，较对照组（未经超声处理）分别提高了39.4%和54.7%，且酶解液具有更窄的分子质量分布范围。这表明超声预处理能促进玉米蛋白向多肽转化，尤其有利于分子质量为200～1 000 u的玉米蛋白肽的形成。

超声预处理 玉米蛋白 频率模式 高效尺寸排阻色谱 分子质量分布

玉米蛋白粉是湿法生产淀粉的副产品，含有60%～71%的蛋白质，其中醇溶蛋白占68%，谷蛋白占28%［1］。玉米蛋白的组成复杂、口感气味不佳、水溶性差，且缺少赖氨酸、色氨酸等必需氨基酸，严重影响了其在食品工业中的应用。目前国内主要将玉米蛋白用于饲料工业或自然排放，导致玉米蛋白质资源得不到充分利用。本研究拟采用酶解法对玉米蛋白的分子结构进行修饰，以提高其生物利用效价。

传统酶解方法主要的不足包括反应时间长、酶利用率低、底物转化率低［2］等。超声波技术因其独特的声化学效应，已广泛应用于天然产物的提取［3－6］、多肽制备时蛋白原料［1，7－11］及蛋白酶［1，12－13］的预处理。本研究拟在酶解前采取超声对玉米蛋白进行预处理，以期使得蛋白质暴露出更多的酶切位点，增加底物与酶的接触机会，促进酶解反应的进行，改善其可酶解性。通过试验研究，进行超声预处理参数的优化。

1 材料与方法

1.1 试验材料

玉米蛋白粉（蛋白质量分数58.3%）：邳州奋达淀粉有限公司；碱性蛋白酶Alcalase 2.4L FG（酶活23 400 U／mL）：诺维信（天津）生物技术有限公司；细胞色素 C（12 500 u）、抑肽酶（6 500 u）、杆菌肽（1 450 u）：上海源叶生物科技有限公司；氧化型谷胱甘肽（612 u）、还原型谷胱甘肽（307 u）：Sigma－Aldrich公司。

1.2 主要仪器

脉冲扫频超声波设备：江苏大学本课题组自主研制、无锡泛博生物工程有限公司制造；Ulti-Mate3000高效液相色谱系统：美国DIONEX公司。

1.3 试验方法

1.3.1 超声频率模式的确定

1.3.1.1 超声频率模式设定：超声频率可设定的模式包括单频和双频、定频和扫频。单频定频及扫频的频率用fi±Δf表示，双频定频及扫频频率及组合用 fi±Δf／fj±Δf表示，其中下标 i，j分别为 1、2、3、4和 5，对应的 fi或 fj依次分别为 24、28、33、40和 68 kHz，Δf为 0、2 kHz。

1.3.1.2 玉米蛋白超声波预处理：称取玉米蛋白粉10 g，加入蒸馏水200mL，使得料液比达到1∶20 g／mL，在超声频率模式及参数设计的基础上研究预处理过程：温度30℃，超声功率密度60 W／L、脉冲超声的工作时间10 s和间歇时间5 s、扫频周期100 ms、时间60 min。对照组以磁力搅拌代替，温度与时间同超声处理组的保持一致。

1.3.1.3 玉米蛋白酶解修饰：超声处理后的玉米蛋白悬浮液，蒸馏水稀释至同一体积，50℃预热10 min，利用Alcalase 2.4L进行酶解。酶解条件为：底物质量分数2%，酶底比［E］／［S］4 740 U／g、反应温度50℃、pH 9、酶解时间60min。酶解结束后，用0.1 mol／L HCl调节pH至7.0并在沸水浴中灭酶10 min，冷却到室温后于5 000 r／min离心15min，收集清液备用。

每个试验点平行重复3次，测定溶解率和水解度，结果以平均值±标准差表示。

1.3.2 超声预处理工作参数优化

考察的因素为温度、料液比、超声处理时间、超声扫频周期、脉冲超声工作时间、脉冲超声间歇时间、单位体积超声功率。每个因素的水平设计如下：温度（℃）：20、30、40、50，料液比（g／mL）：1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50，超声处理时间（min）：10、20、30、40、60，超声扫频周期（ms）：18、50、100、150、200、300、500、700，脉冲工作时间（s）：10、12、15、18，脉冲间歇时间（s）：3、4、5、6，超声功率密度（W／L）：48、60、80、100、120。

1.3.3 测定方法

1.3.3.1 水解度（DH）（pH－stat法测定［14］）

式中：htot为摩尔肽键数，玉米蛋白为9.2 mmol／kg；α为簇氨基在蛋白底物中平均解离度，Alcalase在pH 9.0、50℃的试验条件下，1／α为1.01；Mp为底物蛋白质量／g；Nb为碱液物质的量浓度／mol／L；B为消耗的碱液体积／mL。

1.3.3.2 溶解率（DR）

式中：C为可溶性氮含量，采用福林－酚法测定［15］／mg／mL；V为酶解液体积／mL；N0为底物蛋白含量／g。

1.3.3.3 高效液相排阻色谱工作条件

色谱柱：TSKgel G2000SW XL（规格7.8 mm×300mm ×5μm），流动相：V三氟乙酸∶V乙腈∶V水＝0.1∶45∶55，检测波长：220 nm，进样量：10μL，流速：0.5 mL／min，柱温：30℃。

2 结果与分析

2.1 超声频率模式及频率参数的影响

超声频率模式及频率参数对玉米蛋白水解度及溶解率的影响结果如图1所示。

由图1可知，经超声预处理后玉米蛋白的水解度及蛋白溶解率明显高于对照组；整体讲，双板优于单板，扫频优于定频。超声波的频率增加，膨胀和压缩循环的时间缩短，若膨胀循环时间太短，微小泡核不能长到足够大引起液体介质的破裂、形成空化气泡，空化作用强度下降，超声化学效应相应下降；因此，当超声波强度一定时，频率越高，空化作用越小［16］。从超声处理后玉米蛋白的水解度及溶解率来看，最优超声频率模式为（68±2）kHz／（28±2）kHz，后续试验以此模式进行。

2.2 超声预处理工作参数的优化

2.2.1 超声预处理温度的确定

在其他工作参数同1.3.1的条件下进行超声预处理，酶解温度对蛋白水解度及溶解率的影响试验

图1 超声频率模式对玉米蛋白水解度及溶解率的影响

结果如图2所示，同时进行了对照试验。

图2 温度对玉米蛋白水解度及溶解率的影响

由图2可知，超声预处理后，蛋白的水解度与溶解率都明显高于对照组。随超声处理温度的升高，水解度变化不大，而酶解液溶解率呈现明显的先升后降的趋势。温度升高，蛋白颗粒溶胀，在空化泡破裂的瞬间产生强大的冲击波，能够击碎淀粉之间的交联作用，有利于蛋白的溶出，同时超声波能暴露出蛋白质的酶切位点，增加底物与酶的接触机会；另一方面，温度升高的同时，液体媒介的蒸汽压增加，从而崩溃时伴随产生的最大压力值Pmax降低［16］，空化作用减弱。经方差分析，在温度30℃与40℃的条件下，蛋白的水解度及溶解率没有显著性差异（P＞0.05），故选取温度为30℃。

2.2.2 最佳料液比的确定

在料液温度为30℃、其他工作参数同1.3.1的条件下进行超声预处理，料液比对酶解效果的影响如图3所示。

图3 料液比对玉米蛋白水解度及溶解率的影响

由图3可知，在一定的料液比范围内，蛋白水解度与溶解率均随料液比增大而增大，随后下降。料液比越大、单位体积的颗粒分布越密集，在超声空化效应作用下，颗粒之间的碰撞次数增多，反之，料液比越小，颗粒之间的碰撞机会减小；但料液比过大，在超声波与热的共同作用下，体系的黏度增加，空化效应会减弱。因此，选取料液比1∶20为宜。

2.2.3 超声处理时间的确定

在料液温度为30℃、料液比为1∶20、其他工作参数同1.3.1的条件下进行超声预处理，超声处理时间对蛋白水解度及溶解率的影响如图4所示。

图4 超声处理时间对玉米蛋白水解度及溶解率的影响

从图4可以看出，随着超声处理时间的增加，蛋白的水解度变化不明显，但蛋白溶解率呈上升趋势，40 min后趋于平缓。超声处理时间越长，溶解出来的蛋白越多，但是可酶解的底物蛋白含量基本一致；另一方面，释放出来的蛋白颗粒可能重新聚集，在酶的作用下得以舒展，但还未达到酶解的程度，因此水解度不变，溶解率升高。Jayani等［17］利用20 kHz、31 W的超声处理乳清蛋白60 mL，观察发现当超声处理时间＞5 min时，热焓增加，表明了蛋白聚集的可能性。从而，超声处理时间选取40 min为宜。

2.2.4 超声扫频周期的确定

在料液温度为30℃、料液比为1∶20、超声处理时间为40 min、其他工作参数同1.3.1的条件下进行超声预处理，超声扫频周期对蛋白水解度及溶解率的影响如图5所示。

图5 扫频周期对玉米蛋白水解度及溶解率的影响

由图5可知，超声扫频周期对蛋白水解度和溶解率的影响都比较明显，两者的变化趋势大致一致。在0～100 ms和200～500 ms范围内，两者都呈上升趋势；100～200 ms之间，两者均有不同程度的下降。毛舒云等［18］利用扫频超声处理玉米醇溶蛋白时，发现扫描周期为100 ms时，水解度和ACE抑制率发生突变，认为100 ms是产生显著共振的开启点。在相同的时间内，扫频周期的长短，直接影响到波形、波长大小及波数；当两列波叠加时，产生的效果也截然不同。从图5来看，选择扫描周期500 ms比较合适。

2.2.5 超声脉冲工作时间及脉冲间歇时间的确定

在料液温度为30℃、料液比为1∶20、超声处理时间为40 min、扫描周期500 ms、其他工作参数同1.3.1的条件下进行超声预处理，超声脉冲工作时间及脉冲间歇时间对蛋白水解度及溶解率的影响如图6a～图6b所示。

图6 脉冲工作时间及脉冲间歇时间对玉米蛋白水解度及溶解率的影响

超声波间歇性的发出，可以显著增加对处理对象的作用效果［19］。由图6a～图6b可知，随脉冲工作时间和间歇时间的延长，蛋白水解度及溶解率均有不同程度的下降，脉冲超声时间长，在相等的超声处理时间下，产生的空化泡数量相对较多，一些空化泡在来不及膨胀的状况下就已经破裂，对媒介产生的冲击力较小；间歇时间越长，物料受到的超声作用有较长的时间恢复到原始状态。从图6来看，选择脉冲工作时间10 s、间歇时间3 s为宜。

2.2.6 超声功率的确定

在料液温度为30℃、料液比为1∶20、超声处理时间为40 min、扫描周期500 ms、脉冲超声工作时间10 s、间歇时间3 s的条件下进行超声预处理，超声功率对蛋白水解度及溶解率的影响如图7所示。

图7 超声功率对玉米蛋白水解度及蛋白溶解率的影响

从图7可以看出，单位体积超声功率对蛋白水解度的影响不大，对其溶解性的影响相当明显。功率过低，包裹在蛋白外面的淀粉颗粒不能被击碎，从而不利于蛋白的释放；但功率过大，体系温度会上升，空化作用减弱；另一方面，游离出的蛋白质颗粒会重新形成聚集体［20］，其溶解性降低，同时，蛋白的酶切位点可能被包埋起来，降低了与酶的接触机会。因此，选取超声功率为80 W／L。

2.3 验证试验

在以上优化得出的最佳超声频率模式及工作参数的条件下对玉米蛋白进行预处理，同时作对照试验，酶解效果如图8所示。

图8 超声辅助酶解和常规酶解（对照）的酶解效果比较

从图8可以看出：玉米蛋白超声预处理后，其水解度为23.6%，与传统酶解的水解度17.0%相比，提高了39.4%；蛋白溶解率由传统酶解的48.6%提高至75.2%。经方差分析，超声预处理对玉米蛋白的水解度及溶解率均有显著性的提高（P＜0.05）。

2.4 分子质量分布范围的确定

以标准品分子质量的对数值为纵坐标，保留时间为横坐标，得到校准曲线，如图9所示。分别取超声辅助酶解和常规酶解的酶解液1 mL，稀释10倍，过0.22μm尼龙膜，上样，其洗脱曲线如图10所示，分子质量分布如表1所示。

图9 标准分子质量校准曲线

图10 超声辅助酶解和常规酶解的酶解液洗脱曲线

表1 超声辅助酶解和常规酶解的酶解液分子质量分布

从图10和表1可以看出，无论是超声辅助酶解，还是常规酶解，玉米蛋白酶解液的分子质量分布均是连续的，范围主要集中在200～1 000 u。超声辅助酶解的酶解液具有更窄的分子质量分布，Zhu等［10］和Yang等［21］结果表明超声处理在某种程度上能抑制小肽的形成。其原因可能在于：超声预处理能暴露出蛋白质的疏水性氨基酸［8］，本研究所选的蛋白酶为碱性蛋白酶，其作用位点要求在水解点羧基侧有芳香族或疏水性氨基酸［22］，但它优先水解不带电荷疏水性的较大分子质量蛋白质或肽键［23］；而常规酶解方法，酶作用的位点及有效酶解蛋白量相对较少，使得大分子片段及游离氨基酸含量相对较高。

3 结论

3.1 超声预处理能提高玉米蛋白的水解度，增加其溶解率，得出最佳超声工作频率模式：双频扫频（68±2）kHz／（28±2）kHz。

3.2 基于最佳频率模式，得出超声预处理的最佳工作参数：温度30℃，料液比1∶20 g／mL，超声处理时间40min，扫描周期500ms，脉冲超声时间10 s，脉冲间歇时间3 s，单位体积超声功率80 W／L。

3.3 最佳超声工作条件下处理的玉米蛋白，在Alcalase 2.4L FG、底物质量分数 2%、［E］／［S］4740 U／g、温度50℃、pH 9.0、时间60 min的酶解条件下，其水解度为23.6%，比常规酶解提高了39.4%；蛋白溶解率为75.2%，比对照组提高了54.7%。

3.4 高效尺寸排阻色谱结果显示：与常规酶解的酶解液相比，玉米蛋白经超声预处理后，酶解液具有更窄的分子质量分布范围，该方法有利分子质量为200～1 000 u玉米肽的形成。

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Effects of Ultrasound Pretreatment on the Enzymatic Hydrolysis of Corn Gluten Meal

Jin Jian Ma Haile Qu Wenjuan Zhou Cunshan Luo Min He Ronghai Hong Chen Weng Longmei
（School of Food and Biological Engineering Jiangsu Provincial Key Lab for Physical Processing of Agri－products Jiangsu University，Zhenjiang 212013）

To study the effects of ultrasound pretreatmenton the degree of hydrolysis（DH）and dissolution ratio（DR）of corn gluten meal（CGM）.The ultrasonic frequency mode（single frequency，dual－frequency，fixed frequency and sweep frequency），and the operating parameters of ultrasound on the enzymatic hydrolysis of CGM were optimized.The High perfermance size exclusion chromatography（HPSEC）was utilized to characterize themolecular weight（MW）distribution of hydrolysate.The results showed that the optimal condition of ultrasonic frequencymode was（68±2）kHz／（28±2）kHz；the optimum operating pretreatment parameters conditionswere temperature of ultrasonic condition at30℃，ultrasonic treatment time of40min，pulsed on－time 10 s on and off－time3 s off，cycle time of the sweep frequency 500 ms，and ultrasonic power density 80 W／L.The pretreated CGM was subsequently hydrolyzed byAlcalase2.4L with an enzyme／substance ratio of 4 740 U／g，temperature at 50℃，pH 9.0 and 60 min.Under the optimum condition of ultrasonic frequencymode and operating parameters，the DH and DR of CGM were as23.6%and 75.2%，which were 39.4%and 54.7%higher than thatof the control respectively.The results indicated that the ultrasonic pretreatment could have a facilitative effect on the enzymatic hydrolysis of CGM，which will promote the conversion of protein to peptides，especially the peptideswith a MW of 200～1 000 u.

ultrasound pretreatment，corn glutenmeal，frequencymode，high performance size exclusion chromatography，molecular weight distribution

TS201.1

A

1003－0174（2015）11－0058－07

863计划 （2013AA102203），国家自然科学基金（3130 1423），江苏省产学研前瞻性研究（BY2013065－01），江苏省普通高校研究生科研创新计划（CXZZ13＿0695）

2014－04－11

金建，男，1986年出生，博士，生物大分子的功能化

马海乐，男，1963年出生，教授，食品物理学加工方法