Southern杂交技术在农作物遗传转化研究中的应用

代 军

(辽宁民族师范高等专科学校，辽宁阜新 123000)



Southern杂交技术在农作物遗传转化研究中的应用

代 军

(辽宁民族师范高等专科学校，辽宁阜新 123000)

Southern杂交技术作为分子生物学中的经典技术，为特定DNA片段的检测提供了快速、准确、灵敏的方法。在植物遗传转化研究中，Southern杂交技术广泛应用于外源基因的检测及拷贝数的鉴定工作，为植物转基因研究的准确性提供了充分的保障。综述了Southern杂交技术在水稻、玉米、小麦、大豆等主要农作物遗传转化研究中的应用，可为农作物转基因研究方法的明确及转基因食品安全检测方法的探索提供参考。

Southern杂交；农作物；遗传转化；外源基因检测

Southern杂交技术由英国科学家埃德温·迈勒·萨瑟恩(E.M.Southern)于1975年创立，此技术现已成为检测特定DNA片段的经典方法[1]。该方法利用硝酸纤维膜或尼龙膜等可以吸附DNA的功能，将DNA电泳后的DNA区带吸附到膜上，随后在膜上进行同位素标记探针与被测DNA之间的杂交，最后通过放射自显影对杂交结果进行检测，以此探测DNA 样品中含有的特定DNA信息[2]。Southern杂交技术特异性强，灵敏性高，可应用于检测样品中DNA及其含量，了解基因的状态，如是否存在点突变、扩增重排等，在遗传病诊断、外源基因检测、DNA图谱分析、PCR产物分析等方面均有广泛应用。随着Southern杂交技术的不断成熟，其越来越多地被应用到农作物基因工程基础研究和转基因育种中。

《种子法》规定，水稻、小麦、玉米、棉花、大豆为主要农作物。此外，油菜和马铃薯也被列为主要农作物的范畴。笔者针对主要农作物，综述了Southern杂交技术的应用情况，旨在总结Southern杂交技术在作物分子生物学基础研究和遗传育种中的主要作用及趋势，为更清晰地了解和利用Southern杂交技术提供重要参考。

1 Southern杂交技术在水稻中的应用

水稻(OryzasativaL.)是世界上最重要的粮食作物之一，由于其基因组相对较小，遗传转化体系成熟，已逐渐成为作物分子遗传及基因组研究的模式植物[3]。Southern杂交技术在水稻基因工程研究中起着十分重要的作用，是转基因水稻最为重要的一种检测手段[4]。孙崇荣等[5]利用32P标记的探针进行Southern杂交，验证了水稻叶绿体基因也能编码自身的RNA聚合酶。李宝健等[6]利用电注射法导入外源基因获得转基因水稻植物，通过Southern杂交技术，证实了外源基因在此转化体系中得到了稳定的表达。GUS基因在水稻中的表达[7]、转抗菌肽B基因[8]、抗除草剂转基因水稻[9]、GUS和HPT基因在水稻中的共表达[10]等都是通过Southern杂交技术来验证其转入的整合稳定性。金危危等[11]，徐晓辉[12]，王嵘等[13]，王为民等[14]，张启军等[15]，李聪等[16]，汪小福等[17]，罗伯祥等[18]，向殿军等[19]在水稻转基因等方面的研究也是利用Southern杂交技术作为主要手段进行外源基因检测的。此外，电注射法、低能离子束介导法[20]、基因枪法[21]、水稻花粉管导入法[22]、根癌农杆菌介导法[23-26]等转基因方法的发明与完善，都是利用Southern杂交技术进行验证的。

2 Southern杂交技术在玉米中的应用

玉米(ZeamaysL.)是我国第一大粮食作物，对粮食和饲料生产起着举足轻重的作用[27]。1986年Frommd等[28]用电击法将除草剂pat基因转入玉米原生质体，开创了玉米转基因技术的先例。1990年Gordon-Kamm等[29]首次获得了可育的转基因玉米。随着转基因玉米技术的不断发展和完善，通过基因枪法、农杆菌介导法、花粉管通道法、聚乙二醇(PEG)介导法等主要遗传转化方法，研究人员已将诸多功能基因成功转入玉米，后续功能研究过程均采用了PCR法和Southern杂交技术对目的基因进行了验证。刘小红等[30]利用基因枪法将玉米矮花叶病毒外壳蛋白基因导入玉米优良自交系，通过Southern杂交技术验证了CP基因已成功整合到玉米自交系基因中；黄璐等[31]利用农杆菌介导法建立了成熟的遗传转化体系，利用Southern杂交技术证实了外源基因的转入。李茫雪等[32]利用花粉管通道法将Bt-CPTI双价抗虫基因转入优良玉米自交系中，对转基因植株进行Southern杂交检测，证明外源基因已整合到玉米基因组中。刘铜等[33]利用PEG介导法建立了玉米弯孢叶斑病菌原生质体遗传转化体系，通过Southern杂交技术对转化子进行了验证。常规的Southern杂交技术一般采用同位素标记的方法进行杂交信号检测，但同位素具有强辐射特点，存在一定的安全隐患，近年来研究大都采用更加安全、高效的地高辛标记方法进行杂交检测。王艳辉等[34]，李京等[35]，徐晓露[36]，刘强等[37]，均利用地高辛标记方法对转基因植株的外源基因进行了Southern杂交检测。此外，地高辛标记的Southern杂交技术与PCR技术相结合的PCR-Southern杂交技术也得到了广泛应用[38]。

3 Southern杂交技术在大豆中的应用

大豆蛋白质含量丰富，是唯一能替代动物蛋白的植物性食品。相对于水稻而言，大豆的遗传转化率相对较低，Southern杂交技术鉴定其拷贝数，整合完整性等已成为基础技术。徐香玲等[39]用PCR 检测和Southern杂交技术，鉴定大豆转基因植株呈阳性，证明了外源基因已导入并整合到大豆基因组中；王振华等[40]对转基因大豆T0代植株进行Southern杂交分析，证明了nptⅡ基因成功转入；郝青南[41]利用Southern 杂交技术，证实了大豆基因Gmduf-cbs和Gmdof1.4已成功整合到拟南芥基因组中。宋冰[42]通过农杆菌介导法，将大豆C2H2型锌指蛋白基因SCTF-1、STF-2、STF-3分别转入烟草中，同时通过花粉管通道法导入大豆中，并进行Southern杂交鉴定，结果表明目的基因已成功整合到烟草和大豆基因组中。陆鸿玲等[43]建立了农杆菌介导、草胺膦为筛选剂的大豆转基因体系，通过Southern杂交等方法对转基因大豆进行了分子检测和验证，最后获得了分子特征明确、对草甘膦抗性稳定的抗草甘膦转基因大豆后代。付永平等[44]和郭佩佩[45]也采用根癌农杆菌介导法分别将大豆基因转入模式植物烟草中，并用Southern杂交证实了目的基因已成功整合到烟草基因组中，对进一步研究该基因对大豆的影响做了技术保障。李明春等[46]、李勃[47]、张云月等[48]、范素杰等[49]、王丹等[50]、蓝岚等[51]、贺海生[52]、章洁琼等[53]和张琳等[54]等都利用Southern杂交技术证实了目的基因已成功整合到大豆基因组中。

4 Southern杂交技术在小麦中的应用

小麦是最重要的粮食作物之一，是人类蛋白质的主要摄取来源。作为六倍体作物，小麦拥有较为庞大的基因组，相对水稻而言其转基因研究相对滞后。1992年第一株转基因小麦的报道，是小麦转基因研究的里程碑，此后许多学者利用不同方法将不同目的基因导入小麦，获得转基因小麦，在检测外源基因导入的过程中，很多均采用了Southern杂交的方法[55]。张晓东等[56]利用基因枪法将除草剂Basta抗性基因与小麦HMW谷蛋白亚基基因导入小麦获得转基因植株，应用点杂交和Southern杂交技术对目的基因进行了检测；刘宝等[57]利用Southern杂交技术证实扩增的7B染色体DNA源自小麦基因组，并鉴定了基因拷贝数；于洪欣等[58]利用Southern杂交技术结合PCR检测证实了抗虫基因(CpTI)整合到小麦基因组中。进入21世纪后，转基因小麦研究逐渐增多，Southern杂交技术的应用更加广泛。吴丽芳等[59]首次用低能离子束介导法将GUS基因转入小麦，并用Southern杂交技术鉴定目的基因已成功整合到小麦基因组中。徐琼芳等[60]用基因枪法获得转GNA和bar基因的小麦植株，并用Southern杂交技术加以鉴定。刘伟华等[61]利用基因枪法以菜豆几丁质酶基因转化小麦幼胚愈伤组织，经PCR和PCR-Southern杂交分析，证实菜豆几丁质酶基因已整合到T0和T1小麦基因组中。刘录祥等[62]也利用基因枪法将DREB1A和bar基因转入小麦，通过PCR和Southern 杂交分析，已获得含目的基因的转基因小麦植株。此外，在小麦遗传转化研究中，奚亚军等[63]转叶片衰老抑制基因PSAG12-IPT、侯文胜等[64]转sgna基因、路研等[65]转Rs-AFP2基因、赵同金等[66]转大麦Mlo反义基因、刘欣等[67]转TaPIEP1基因、刘香利等[68]转麦谷蛋白亚基基因、张建红等[69]转pepc基因和余桂红等[70]转高赖氨酸蛋白基因，都用Southern杂交技术对目的基因是否成功整合到小麦基因组中做了进一步鉴定。

5 Southern杂交技术在其他农作物中的应用

除上述几种主要农作物，在油菜、马铃薯、棉花等其他农作物遗传转化研究中，Southern杂交技术的应用同样较为广泛。油菜是位列大豆和棉花之后的第三大油料作物，属十字花科芸薹属，其转基因研究包括转入抗除草剂基因、抗病基因、抗虫基因等。王伏林[71]通过根瘤农杆菌介导法将pCambia-ABCD基因转入油菜抗潮霉素再生苗中，并用Southern杂交技术进行检测，结果证实该基因已成功转入，且该基因在甘蓝型油菜及其近缘种的基因组中呈单拷贝。吴玉俊等[72]在转ChIFN-γ基因油菜植株中通过ELISA定量检测、PCR检测及Southern杂交检测，确定了外源基因的导入。马铃薯是重要的粮食作物，具有多种经济用途。但马铃薯易感染病害，易受干旱影响，所以将抗虫基因、抗旱基因、耐盐碱基因转入马铃薯的研究较常见[73]。侯书国[74]将GNA基因转入马铃薯，对转化后的马铃薯进行PCR-Southern检测和抗除草剂鉴定，证明GNA基因已整合到马铃薯基因组。潘映雪[75]以马铃薯品种克新18号和东农303的脱毒微型薯为研究对象，用农杆菌介导法将抗旱基因BDN1转入马铃薯，经PCR和Southern杂交检测，证明BDN1基因已转入马铃薯基因组中。张正国[76]以马铃薯品种费乌瑞它的脱毒微型薯为外植体，利用农杆菌介导法将BADH耐盐相关基因导入马铃薯，经Southern检测，证明BADH基因己转入马铃薯基因组中。棉花是我国重要的经济作物和纤维作物，也是我国较早开展转基因育种的作物之一。刘正杰[77]应用花粉管通道法研究内源基因GhDGAT1沉默对棉花油分含量的影响，Southern杂交结果表明转基因种子中该基因表达量受到显著抑制。杨云尧[78]利用花粉管通道法将抗逆相关基因转化到棉花中，Southern杂交技术检测结果显示T3代转基因棉花中的MvNHXY基因和MvP5CS基因以单拷贝的形式插入到棉花基因组中。

Southern杂交技术除在基因工程方面的应用广泛外，在鉴定近缘种属同源性、鉴定PCR扩增产物及鉴定特异重复序列等方面也有重大贡献。王苏玲等[79]根据Southern杂交结果，推测出百萨偃麦草可能参与了赖草属物种的形成过程。温亚丽等[80]通过Southern 杂交试验证明毛木耳和紫木耳之间存在较高的同源性，从而进一步证实了在基因组进化上，紫木耳与毛木耳的关系较黑木耳更为密切。孙瑞芬等[81]用内葵杂3号三交种和单交种各自的基因组DNA标记成探针，与随体染色体扩增产物进行Southern杂交，显示杂交信号，证明内葵杂3号三交种和单交种随体染色体DNA已被成功扩增。陈林刚等[82]通过Southern 杂交技术对RHS1、RHS2、RHS3、RHS4、RHS5、RHS6、RHS7、RHS8、RHS9、RHS10和RHS11重复序列进行序列特异性检测，结果表明RHS3、RHS5、RHS8为华山新麦草基因组特异重复序列。

6 小结

Southern杂交技术在水稻、玉米、大豆、小麦、油菜等农作物遗传转化研究中的应用较为广泛，是检测外源基因导入的重要手段。随着农作物转基因技术的不断完善和发展，将会有越来越多的具备优良性状的转基因农作物问世。伴随着转基因食品安全性争议的持续发酵，快速准确的检测转基因成分也将成为农作物转基因研究的重点内容，这就要求研究人员更好地利用和完善Southern杂交、PCR等技术，使之为农作物转基因研究的稳步推进作出更大的贡献。

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Application of Southern Blot in the Genetic Transformation of Crops

DAI Jun

(Liaoning National Normal College, Fuxin, Liaoning 123000)

As one of classical techniques of molecular biology, Southern blot provides a fast, accurate and sensitive method for the detection of specific DNA fragments. In the research of genetic transformation in plants, Southern blot is widely used in the detection of genetic transformation and identification of gene copy number. It provides adequate safeguards for the accuracy of transgenic research. This paper summarizes the application of Southern blot in the staple crops, such as rice, maize, wheat, soybean, etc., which provides references for the definitude of the ways for studying genetic transformation, as well as the explore of the ways for detecting genetically modified food safety.

Southern blot; Crops; Genetic transformation; Detecting exogenous gene

国家林业公益性行业专项资助项目(200904064)。

代军(1965- )，女，辽宁阜新人，副教授，从事农业生物技术方面的研究。

2014-11-12

S 188

A

0517-6611(2015)01-020-04