胆固醇对高脂诱导的非酒精性脂肪肝病的影响

陈中强，翟　莹，尚萍萍，左正宇，李　琦，刘志国

(武汉轻工大学 生物与制药工程学院，湖北 武汉 430023)



胆固醇对高脂诱导的非酒精性脂肪肝病的影响

陈中强，翟莹，尚萍萍，左正宇，李琦，刘志国

(武汉轻工大学 生物与制药工程学院，湖北 武汉 430023)

摘要：研究胆固醇含量对高脂诱导的非酒精性脂肪肝病(NAFLD)的影响。对成年SD雄性大鼠随机分为正常组(CON)和高脂饮食诱导NAFLD组(HF),HF组下分HFC0、HFC1、HFC2和HFC5组，分别对应饲料中添加0%、1%、2%和5%的胆固醇，各组于饲养4周和8周结束时断头取血，检测血清TC、TG含量和ALT、AST活性，对8周的肝组织切片HE染色。结果显示与对照组相比，随着胆固醇摄入量增加，饲喂8周的大鼠体重、肝重及肝比重增加明显；肝形态改变明显，细胞脂质聚积和炎性浸润显著；HFC2、HFC5组于4周时血TC含量、ALT及AST升高显著。研究结果表明：高胆固醇饮食可加重肝脂质聚积、肝功能异常，并促进了非酒精性脂肪肝病的发展。

关键词：NAFLD；胆固醇；脂质聚积

1引言

非酒精性脂肪肝病(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)是指除酒精和其他明确的损肝因素所致的，以弥漫性肝细胞大泡性脂肪变性为主要特征的临床病理综合征，包括非酒精性单纯性脂肪肝(NAFL)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)和肝硬化[1]。流行病学研究显示，全球NAFLD发病率逐年上升，发病年龄也日趋年轻化，已成为当今主要的慢性肝病[2]。NAFLD的发病机制迄今还没有完全阐明，普遍接受的是Day和James的“二次打击”学说[3]。近些年来，随着人们的生活水平不断提高，日常膳食胆固醇所占比例亦大大增加，但胆固醇对NAFLD的具体影响并不十分清楚。

在NAFLD病理进程中，胆固醇、甘油三脂等脂质在肝细胞内聚集是NAFLD发生发展的前提和必要条件[4-7]。研究表明，TG聚积本身对肝细胞损伤并不大，而细胞内游离脂质负荷过载，尤其是游离脂肪酸、游离胆固醇、神经酰胺等脂质成分，则会导致细胞功能失调和细胞凋亡等[8-10]。

本研究通过富含饱和脂肪酸和不同浓度胆固醇的饲料饲喂诱导NAFLD大鼠模型，探讨高饱和脂肪酸条件下不同浓度胆固醇对NAFLD病程的影响。

2材料与方法

2.1　动物

SD雄性大鼠(6周龄、体重为180—200 g )，购自华中科技大学同济医学院动物中心。

2.2　试剂

胆固醇、胆酸盐(美国sigma公司产品)；总胆固醇(TC)、总甘油三酯(TG)、ALT、AST检测试剂盒均购置于南京建成生物研究所；苏木精(BIOSHARP公司产品)；硫酸铝钾(天津市科密欧化学试剂开发中心产品)；多聚甲醛(美国Celanese公司产品)；丙三醇(分析纯，国药集团化学试剂有限公司产品)；冰乙酸(分析纯，湖北大学化工厂产品)；伊红(Generay Biotech (Shanghai)公司产品)；猪油(上海嘉里粮油工业有限公司)。

2.3　仪器

酶标仪(TECAN，DNA Expert),可见光分光光度计(上海尤尼柯仪器公司)，倒置显微镜(olympus),5424R高速低温离心机(Eppendorf，Germany)，电子酸度计(北京赛多利斯仪器系统有限公司)

2.4　方法

2.4.1动物分组及高脂诱导NAFLD

SD大鼠适应性饲喂1周后，随机分为5组，每组6-12只，分别为正常饮食饲喂的对照组(CON组)、高脂饲喂诱导NAFLD模型各组，即HFC0(20%脂肪)组、HFC1(20%脂肪+1%胆固醇)组、HFC2(20%脂肪+2%胆固醇)组和HFC5(20%脂肪+5%胆固醇)组。

2.4.2饲料配方

各实验组大鼠饲料成分比率如表1所示。

表1　各实验组大鼠饲料成分比率　/%

2.4.3动物处理及样本采集

饲喂4周和8周结束时，大鼠禁食24h，自由饮水，称重，断头取血，2 000 rpm离心取上清，备检测用。肝组织称重，取肝右大叶相同部位组织用多聚甲醛固定，石蜡包埋并切片，一部分液氮速冻置于-80 ℃冰箱保存。

2.4.4血脂及肝功能检测

检测TG、TC的含量和ALT、AST的活性，方法按照试剂盒提供说明书进行。

2.4.5HE染色

对各组大鼠相同部位的肝切片进行苏木精和伊红染色处理，观察肝形态结构。

2.4.6统计学分析

3结果

3.1　大鼠体重、肝重、肝比重

大鼠饲喂8周后，高脂组大鼠体重、肝重、肝比重，随着胆固醇浓度的增加，逐步升高。与CON组相比，体重、肝重均从HFC2组开始有显著差异，而肝比重则从HFC1组开始有显著差异(P<0.05)，如图1所示。

图1　18周后大鼠体重、肝重、肝比重变化(n=6, a: vs CON, P<0.05)

3.2　大鼠肝脏颜色和质地变化

CON组大鼠肝脏形态正常，无肿胀，色泽深红有光泽，质软，边缘锐利。HFC0组大鼠肝脏色泽无明显变化，无油腻感，体积略有增大。HFC1组体积进一步增大，色泽微黄，切面油腻。HFC2组较HFC1组体积进一步增大，色泽变黄，边缘圆钝，组织松脆。HFC5组肝脏体积明显增大，整体色泽土黄，油腻感，有明显脂肪斑块(图2)。

图2　8周后各组大鼠肝脏颜色和质地变化

3.3　血清TG、TC含量变化

大鼠饲养4周和8周后，高脂组大鼠血清中TG、TC的含量，随着胆固醇浓度的增加逐步升高。与CON组相比， 4周的TC从HFC2组开始有显著差异，8周的TC从HFC1组开始有显著差异 (P<0.05)，如图3所示。

图3　4周和8周各组大鼠血清TC和TG含量(n=6, a: vs CON, P<0.05)

3.4　血清ALT、AST活性变化

大鼠饲养4周和8周后，HFC2和HFC5组大鼠血清中ALT、AST活性增加显著(P<0.05)(图4)。

图4　4周和8周大鼠血清ALT、AST活性(n=6, a: vs CON, P<0.05)

3.5　肝结构形态观察

HE染色显示，大鼠饲喂8周后，CON组大鼠肝细胞呈放射状整齐排列，胞核及胞质染色清晰，细胞形态正常，肝窦无扩张。HFC0组大鼠可见肝窦微有扩张，肝小叶结构正常，无明显炎性细胞浸润。HFC1组大鼠可见肝腺泡区部分肝细胞胞脂肪变，肝细胞索欠清晰，且肝腺泡区内有散在个别点灶状坏死。HFC2组大鼠肝细胞索进一步模糊，有较多脂滴沉积，肝腺泡区内点灶状坏死增多。HFC5组肝细胞索模糊乃至消失，出现明显气球样变，可见细胞核被脂滴挤压至细胞边缘，腺泡内点灶状坏死明显(图5)。

图5　8周结束后各组大鼠肝组织切片HE染色结果(×400)

4结论

各高脂组大鼠饲喂8周后，肝指数、血脂及肝酶活性指标升高明显，HE染色结果显示高脂高胆固醇饮食肝脏脂质聚积、炎性浸润明显，表明高脂饮食成功诱导了大鼠NAFLD模型。随着饲料中胆固醇含量的增加，肝指数、血脂及肝酶活性指标都相应升高，脂质聚积和炎性浸润相应加重，表明饲料中胆固醇含量的增加能够促进NAFLD病程的进展。同时结果也表明胆固醇和富含饱和脂肪酸的甘油三酯两者的联合作用对肝的损伤要远超出单独的甘油三酯对肝的影响，其具体机理有待进一步探讨。

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[10]Li Q，Liu Z Guo．Cholesterol overloading leads to hepatic L02 cell damage through activation of the unfolded protein response[J].Int J Mol Med，2009，24(4)：459-464． Q，Liu Z Guo．Cholesterol overloading leads to hepatic L02 cell damage through activation of the unfolded protein response[J].Int J Mol Med，2009，24(4)：459-464．

Effect of cholesterol on nonalcoholic fatty liver disease induced by high-fat

CHENZhong-qiang，ZHAIYing，SHANGPing-ping，ZUOZheng-yu，LIQi，LIUZhi-guo

(School of Biology and Pharmaceutical Engineering, Wuhan Polytechnic University,Wuhan 430023,China)

Abstract：To research the effect of cholesterol content on the nonalcoholic fatty liver disease (NAFLD) induced by high fat.Method：The adult male SD rats were randomly divided into the normalgroup (CON) and high-fat diet group (HF).Then the HF group was divided into HFC0, HFC1, HFC2 and HFC5 group, and 0%, 1%, 2% and 1% cholesterol were added into the five HFC groups correspondingly. All rats were beheaded at the 4thand 8thweek, and the organ blood was collected to detect the contentsof the totalcholesterol (TC), the total triglyceride (TG) and the activities of Alanineaminotransferase (AST), Alanine transaminase(ALT).The 8thweeks’ liver tissues embedded inparaffin were stained with hematoxylin and eosin (H&E) to judge inflammatorysituation.Result：After 8 weeks’feeding,compared with the CON group, the body weight, liver weight and the proportion of liver and body weight of the HFC group rats increased significantly with the increase of cholesterol intake. And the liver morphology changes, lipid accumulation and inflammatory infiltration could be easily observed on HFD liver cells. At the 4thweek, the content of TC, activities of ALT and AST increased significantly in the HFC2 and HFC5 group.Conclusion：The results showed the high cholesterol diet can aggravate hepatic lipid accumulation, liver dysfunctionand promote the development of nonalcoholic fatty liver disease.

Key words：NAFLD; cholesterol;lipid accumulation.

DOI:10.3969/j.issn.2095-7386.2015.02.011

文章编号：2095-7386(2015)02-0047-03

通信作者：徐翔(1962-)，男，主任医师，E-mail：498376463@qq.com.

作者简介：韩冯(1981-)，女，硕士，主治医师，E-mail：3348459@qq.com.

收稿日期：2015-03-08.

中图分类号：R 575.5

文献标识码：A