MARVELD1在脑胶质瘤中表达的实验研究*

时毅敏魏川江唐世洁唐世平戴黎萌

MARVELD1在脑胶质瘤中表达的实验研究*

时毅敏①魏川江②唐世洁②唐世平②戴黎萌③

目的：探讨人脑胶质瘤组织中MARVELD1 的表达。方法：RT-PCR和Western blot技术检测33例脑胶质瘤组织蛋白和mRNA的表达，并以11例正常脑组织为对照。结果：相较于正常脑组织，Ⅰ级、Ⅱ级、Ⅲ级、Ⅳ级脑胶质瘤组织中MARVELD1蛋白和mRNA的表达水平差异均有统计学意义（P＜0.05），Ⅲ级、Ⅳ级脑胶质瘤组织中MARVELD1蛋白和mRNA的表达水平低于Ⅰ～Ⅱ级脑胶质瘤组织和正常脑组织（P＜0.05）。结论：MARVELD1对脑胶质瘤恶性程度判断有一定的指导意义，并为脑胶质瘤临床治疗提供了新的靶标。

脑胶质瘤； MARVELD1； 实验研究

脑胶质细胞瘤是来源于神经上皮的颅内最常见的原发性肿瘤，占颅内肿瘤的40％～50％，胶质细胞瘤患者的治疗主要以积极的手术、放、化疗等治疗措施为主，但该肿瘤多呈浸润性生长，手术不易全切[1-2]。患者预后仍较差，WHO分级Ⅲ级的胶质细胞瘤患者平均生存期约3～5年，多形性胶质母细胞瘤患者平均生存期尚不足1年[3-4]，因此寻找新的脑胶质瘤治疗靶点成为当前亟待解决的难题。MARVELD1基因是定位于人类10号染色体长臂10q24.2的一个新的候选抑癌基因，该基因在多种正常组织中表达，而在乳腺癌、肺癌、肾癌等多种癌症中 MARVELD1基因的表达呈明显下调[5-6]。因此本研究通过对不同病理级别脑胶质瘤组织中MARVELD1的表达，以期从MARVELD1在其发病机制中的调控作用，为脑胶质瘤的靶向治疗提供新思路。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2013年1月-2014年4月入住本院神经外科的符合脑胶质瘤的患者33例。患者均为初发，术前未接受放、化疗等治疗，其中男18例，女15例，年龄7～70岁，平均（40.2±19.3）岁；星形胶质细胞瘤20例，少突胶质细胞瘤3例，室管膜细胞瘤5例，髓母细胞瘤3例，多形性胶质母细胞瘤1例，胶质肉瘤1例；按照2007年WHO神经肿瘤分类标准进行病理分级，其中I～II级15例，III级10例，IV级8例。另取11例来自同期收治的脑外伤或脑出血患者的正常脑组织标本作为对照，患者男6例，女5例，年龄16～47岁，平均（32.3±12.3）岁。两组患者在性别、年龄方面比较差异均无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。

1.2 主要仪器与试剂 荧光定量PCR仪及分析软MXPro 4.01（Stratagene公司）；凝胶成像系统（柯达公司）。一抗兔抗人MARVELD1单克隆抗体（Abcam）；兔抗羊免疫荧光IgG二抗（美国Santa Cruz公司），TRIzol试剂盒（Gibco 公司），RT-PCR引物由Takara生物技术有限公司合成，逆转录-聚合酶链反应（RTPCR）试剂盒为公司产品。

1.3 检测方法

1.3.1 标本采集 符合纳入标准的脑胶质瘤的患者与11例健康正常者均收集手术切除的新鲜脑胶质瘤标本，标本均经病理确诊，离体后0.5 h内转至-80 ℃低温冰箱冻存。手术切除后标本分成两部分，一部分用于MARVELD1 mRNA的检测，另一部分用于MARVELD1蛋白的检测。

1.3.2 RT-PCR检测脑组织 MARVELD1 mRNA表达 采用TRIzol 法抽提总RNA，将 RNA反转录成cDNA。取1 μL作为模板进行 RT-PCR反应。MARVELD1引物序列，上游：5'-GAGGAAGTAGATTGCTGCCTCTAG-3'；下游：5'-GAGAGCGGTCGGTGTGACCAGCTCTG-3'。β-actin引物序列，上游：ATGGG TCAGA AGGATTCCT ATGTG；下游：CTTCATGAGGTAG TCAGT CA GGTC。RT-PCR反应条件：95 ℃预变性5 min；95 ℃ 30 s、55 ℃ 30 s、72 ℃延伸 1 min（30 cycle）；72 ℃终延伸10 min。

1.3.3 Western Blot检测PBMC中MARVELD1蛋白的表达水平 取适当脑组织加入液氮快速研磨后，加入相应体积的裂解液，放置冰上充分作用30 min后；收集裂解物入，4 ℃离心30 min，-80 ℃冻存。采用蛋白免疫印迹法（Western blot）检测MARVELD1 蛋白的变化，进行SDS-PAGE凝胶电泳，转膜与封闭，一抗及二抗孵育。在凝胶成像仪上扫描条带，以其和内参β-actin灰度值的比值来反映其相对含量。

1.4 统计学处理 采用SPSS 16.0统计软件对数据进行分析，计量资料以（±s）表示，比较采用t检验，计数资料采用 χ2检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 脑胶质瘤组织与健康正常脑组织mRNA的提取 琼脂糖凝胶电泳结果显示，脑胶质瘤脑组织Ⅰ～Ⅱ级、Ⅲ级、Ⅳ级与健康正常脑组织总RNA均可见清晰的18S和28S条带，说明总RNA纯度基本达到实验要求，且样品保存质量较好无明显降解；对提取的mRNA用紫外分光光度计测量A260/A280值为1.8～2.0，说明mRNA总量及质量满足实时定量荧光RT-PCR的要求。

2.2 脑胶质瘤脑组织与健康正常脑组织标本中MARVELD1mRNA水平的表达差异 为验证MARVELD1在脑胶质瘤组织中的表达情况，用RT-PCR检测MARVELD1 mRNA的表达，如图1、表1所示，相较于正常组织，MARVELD1 mRNA在脑胶质瘤Ⅰ～Ⅱ级、Ⅲ级、Ⅳ级组织中相对表达降低，且Ⅲ级和Ⅳ级组织低于Ⅰ～Ⅱ级，差异均有统计学意义（P＜0.05），表示MARVELD1 mRNA在脑胶质瘤组织中特异表达显著下调。本实验均以β-actin为内参，应用商品化的引物，得到的溶解曲线为单峰，结果符合要求。

图1 各组MARVELD1 mRNA水平的表达差异注：1 正常组织，2 脑胶质瘤Ⅰ～Ⅱ级，3 Ⅲ级，4 Ⅳ级

表1 各组MARVELD1 mRNA水平的表达差异

2.3 脑胶质瘤脑组织与健康正常脑组织标本中MARVELD1蛋白水平的表达差异 提取正常组织和脑胶质瘤Ⅰ～Ⅱ级、Ⅲ级、Ⅳ级组织的蛋白，用western bloting检测MARVELD1蛋白的表达，如图2、表2所示，MARVELD1在脑胶质瘤Ⅰ～Ⅱ级、Ⅲ级、Ⅳ级组织中相对表达降低，且Ⅲ级和Ⅳ级组织低于Ⅰ～Ⅱ级，差异均有统计学意义（P＜0.05），表示MARVELD1 蛋白在脑胶质瘤组织中特异表达显著下调。

图2 各组MARVELD1 蛋白水平的表达差异注：1 正常组织，2 脑胶质瘤Ⅰ～Ⅱ级，3 Ⅲ级，4 Ⅳ级

3 讨论

MARVELD1 是癌症发生及转移的分子机制过程中发现的一个新的候选抑癌基因，其含有一个较为保守的膜相关结构域MARVEL （MAL and related proteins for vesicle trafficking and membrane link，具有囊泡运输和膜连接功能的MAL及相关蛋白），MARVEL结构域的蛋白参与了clathrin调节的细胞内吞作用、细胞凋亡、突触囊泡的融合、细胞的趋化活力、成肌细胞的融合和紧密连接等相关进程[7-8]。MARVELD1 mRNA全长3238bp，含有两个外显子，编码区位于第一外显子内，其编码蛋白含有173个氨基酸，预测分子量约为18.9 kDa[9]。MARVELD1 蛋白定位于细胞核和线粒体中，而在细胞质中的含量很少[10]。

表2 各组MARVELD1蛋白水平的表达差异

MARVELD1作为一个新的候选抑癌基因，在多种正常组织中表达，而且与癌旁对照相比，P. M. Alves等通过大规模基因表达谱分析发现MARVELD1 在结肠癌中处于高表达状态[11-12]。通过ONCOMINE网站的基因表达谱数据检索发现MARVELD1 在男性生殖细胞肿瘤中的表达明显高于正常的睾丸组织；在多形性胶质母细胞瘤、少突胶质细胞瘤以及星形细胞瘤中的表达则明显低于正常脑组织；在前列腺腺癌中的表达也低于正常前列腺组织[13-14]。采用肿瘤表达芯片对19种不同类型的原发肿瘤样本，系统分析了MARVELD1基因在多种人类原发癌中的表达情况，发现在154对病例中有69对（45％）MARVELD1基因在肿瘤组织中出现了表达下调，特别是肾癌、膀胱癌、乳腺癌、肝癌，以及卵巢癌、子宫癌、女性外阴癌、宫颈癌和睾丸癌等生殖系统肿瘤中MARVELD1基因的表达受到明显的抑制[15-16]。

本研究发现，脑胶质瘤组织中MARVELD1蛋白和mRNA表达水平均低于正常脑组织，并且随胶质瘤细胞分化程度的降低（ 病理级别的升高）而逐渐下降，表明MARVELD1基因表达下调可能是脑细胞发生恶性转化的原因之一，提示MARVELD1可作为脑胶质瘤恶性程度判断的辅助指标用于临床。

综上所述，通过检测脑胶质瘤组织中MARVELD1的表达，可能对脑胶质瘤恶性程度及预后的判断有一定的指导意义，并为脑胶质瘤临床治疗提供了新的靶标。

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Expression of MARVELD1 in Human Glioma Tissue

SHI Y i-min，WEI Chuan-jiang，TANG Shi-jie，et al.//Medical Innovation of China，2015，12（09）：037-039

Objective：To explore the relationship the expression of autophagy-related gene MARVELD1 in human glioma tissue. Method： Western blot and RT-PCR technology were used to detect the expressions of MARVELD1 protein and mRNA in 33 cases of glioma tissue and 11 cases of normal brain tissue. Result：There were significant differences in the expressions of MARVELD1 protein and mRNA among normal brain tissue grade Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ andⅣ glioma tissue（P＜0.05）. The expressions of MARVELD1 protein and mRNA in grade Ⅲ and grade Ⅳ glioma tissue were lower than those in grade Ⅰ， grade Ⅱ glioma tissue and normal brain tissue（P＜0.05）. The expression of MARVELD1 protein in grade Ⅰ and grade Ⅱ glioma tissue was lower than that in normal brain tissue（P＜0.05）. Conclusion： MARVELD1 of glioma malignancy judge has a certain significance， and provides a new target for the clinical treatment of glioma.

Glioma； MARVELD1； Experimental research

10.3969/j.issn.1674-4985.2015.09.012

2014-08-07） （本文编辑：蔡元元）

广东省深圳市科技计划项目（201203374）

①广东省深圳市光明新区中心医院 广东 深圳 518107

②广东省深圳市光明新区人民医院

③广东省深圳市人民医院

时毅敏

First-author’s address：Shenzhen Guangming New District Central Hospital，Shenzhen 518107，China