舒芬太尼后处理对2型糖尿病大鼠心肌缺血再灌注损伤的影响及其与PI3K-Akt通路的关系*

任 强王建刚田首元

舒芬太尼后处理对2型糖尿病大鼠心肌缺血再灌注损伤的影响及其与PI3K-Akt通路的关系*

任 强①王建刚②田首元②

目的：研究舒芬太尼后处理对2型糖尿病大鼠心肌缺血再灌注损伤的影响及其与磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）-蛋白激酶B（Akt）通路的关系。方法：健康雄性SD大鼠24只，体重180～200 g，采用随机数字表法将其随机分为四组（n=6）：非糖尿病假手术组（NDM-S组）、非糖尿病缺血再灌注组（NDM-I/R组）、非糖尿病舒芬太尼后处理组（NDM-SP组）、非糖尿病舒芬太尼后处理+渥曼青霉素（PI3K抑制剂）组（NDMSP+W组）。另取健康雄性SD大鼠，采用高糖高脂饮食喂养6周诱导胰岛素抵抗+腹腔注射链脲佐菌素35 mg/kg的方法制备2型糖尿病模型（血糖≥16.7 mmol/L），选取造模成功的大鼠24只，继续高糖高脂喂养2周后采取随机数字表法，将其分为四组（n=6）：糖尿病假手术组（DM-S组）、糖尿病缺血再灌注组（DM-I/R组）、糖尿病舒芬太尼后处理组（DM-SP组）、糖尿病舒芬太尼后处理+渥曼青霉素组（DM-SP+W组）。采用左冠状动脉前降支下穿线或结扎，阻断30 min，再灌注120 min的方法制备大鼠心肌缺血再灌注的模型。其中假手术组只穿线不结扎；缺血再灌注组穿线后稳定5 min，阻断30 min，再灌注120 min；舒芬太尼后处理组于再灌注前5 min经舌下静脉注射舒芬太尼1.0 μg/kg；舒芬太尼后处理+渥曼青霉素组于再灌注前5 min经舌下静脉注射渥曼青霉素15 μg/kg和舒芬太尼1.0 μg/kg。再灌注120 min后取血样，测定肌钙蛋白cTnI的浓度；处死后收集心肌组织，采用TUNEL法测定心肌细胞的凋亡指数（AI），采用Western blot法检测心肌组织Akt、p-Akt的表达水平。结果：非糖尿病和糖尿病大鼠I/R组、SP组、SP+W组与S组相比较，血浆cTnI的浓度升高、AI增加、p-Akt的表达增加（P＜0.05）。舒芬太尼后处理可明显减轻NDM组的心肌缺血再灌注损伤，使升高的cTnI浓度降低、AI降低、p-Akt的表达增加（P＜0.05），而对DM组心肌缺血再灌注损伤的各项指标均无明显的影响。NDM-SP组的血浆cTnI的浓度、AI明显低于DM-SP组而p-Akt的表达高于DM-SP组。结论：舒芬太尼后处理对2型糖尿病大鼠心肌缺血再灌注损伤没有保护作用，PI3K-Akt通路不参与该过程。

舒芬太尼后处理； 2型糖尿病； 心肌缺血再灌注损伤； PI3K-Akt

随着我国进入人口老龄化社会，糖尿病（diabetes mellitus DM）严重的威胁着人类的健康，已经成为缺血性心脏病最重要的易患因素，糖尿病人群更易罹患冠心病导致的心肌梗死和梗死后并发症[1]。2型糖尿病作为最普遍的糖尿病类型，在糖尿病人群中占有很大的比重。因此，减轻由2型糖尿病因素导致心肌缺血再灌注损伤就显的具有迫切的临床意义。舒芬太尼是一种强阿片类镇痛药，具有消除半衰期短、镇痛作用强、血流动力学影响轻微等优点，被广泛应用于心血管手术的麻醉[2]。研究表明，舒芬太尼后处理可减轻非糖尿病大鼠心肌缺血再灌注损伤，其机制与PI3K-Akt通路有关[3]，但是舒芬太尼后处理对2型糖尿病大鼠的心肌缺血再灌注损伤是否有保护作用及其与PI3K-Akt通路的关系，目前的研究尚不多见。本实验拟研究舒芬太尼后处理对2型糖尿病大鼠心肌缺血再灌注损伤的影响及其与PI3K-Akt通路的关系。

1 材料与方法

1.1 实验动物 健康雄性SD大鼠，体重180～200 g，山西医科大学动物实验中心提供。参展文献[4]的方法制备2型糖尿病模型。高糖高脂饲养6周后，腹腔注射链脲佐菌素（批号：905B0314，Solarbio公司）35 mg/kg，72 h后测量空腹血糖≥16.7 mmol/L并伴有糖尿病症状（多食、多饮、多尿、毛发变黄等）即可视为2型糖尿病大鼠模型制备成功，继续高糖高脂饲养2周后可用于本实验。温度18～25℃，湿度50％～60％，自由饮水。

1.2 实验分组 取健康的正常SD大鼠24只，按照随机数字表法将其分为四组（n=6）：非糖尿病假手术组（NDM-S组）、非糖尿病缺血再灌注组（NDM-I/R组）、非糖尿病舒芬太尼后处理组（NDM-SP组）、非糖尿病舒芬太尼后处理+渥曼青霉素组（NDM-SP+W组）。另取造模成功的糖尿病大鼠24只，按照上述方法分为四组（n=6）：糖尿病假手术组（DM-S组）、糖尿病缺血再灌注组（DM-I/R组）、糖尿病舒芬太尼后处理组（DM-SP组）、糖尿病舒芬太尼后处理+渥曼青霉素组（DM-SP+W组）。

1.3 心肌缺血再灌注模型的制备 参照文献[5]进行大鼠心肌缺血再灌注模型的制备。腹腔注射20％的乌拉坦3 mL/kg麻醉后，仰卧位固定于实验台上，针状电极刺入左、右前肢和右后肢皮下，动态监测Ⅱ导联心电图。行气管切开置管并连接HX-300小型动物呼吸机行机械通气，呼吸机参数设置为：潮气量8～10 mL，吸呼比1：2，频率65 次/min。于左侧胸壁第3～5肋间胸骨左缘0.5 cm处开胸，钝性分离肌肉，剪断肋骨打开胸腔，暴露出心脏并剥离心包膜，以左冠状静脉主干为标志，在左心耳下方可见一明显的血管即为左冠状动脉前降支，用7-0线结扎左冠状动脉前降支，制备心肌缺血再灌注模型。造模成功的标志为：结扎后心尖部缺血发白，心电图ST段抬高，T波高耸，结扎线以下心肌组织发绀并活动减弱；松开结扎线后，心电图抬高ST段或T波逐渐回落，心肌组织反应性充血。上述S组只穿线不结扎；SP组于再灌注前5 min经舌下静脉注射舒芬太尼（批号1130902，宜昌人福医药有限责任公司）1.0 μg/kg；SP+W组于再灌注前5 min分别经舌下静脉注射渥曼青霉素（批号LG10014，北京百灵威科技有限公司）15 μg/kg、舒芬太尼1.0 μg/kg。

1.4 cTnI的测定 再灌注120 min后，大鼠开腹找到腹主动脉取血2 mL，4 ℃ 4000 rpm/min离心15 min，后移取上清液于-80 ℃冰箱中保存。使用ELISA法检测血清中cTnI浓度（试剂盒由武汉博士德生物工程有限公司提供）。

1.5 TUNEL法检测心肌细胞凋亡 再灌注120 min后取下心尖组织，4％多聚甲醛固定，常规石蜡切片。按TUNEL细胞凋亡检测试剂盒（试剂盒由武汉博士德生物工程有限公司提供）说明书进行操作：切片后常规脱蜡后用PBS缓冲液漂洗，3％H2O2封闭内源性过氧化物酶，蛋白酶K消化，加TUNEL反应液，漂洗，加酶标抗体，DAB显色，苏木素复染。每张切片光镜（400倍）下随机选取5个高倍视野，计算凋亡指数（apoptotic index，AI），即凋亡细胞数占心肌细胞总数的百分比，取5个视野的平均值。

1.6 心肌Akt、p-Akt蛋白表达的测定 再灌注120 min后取左心室100 mg，用生理盐水漂洗数次，剪碎后加入裂解液，14 000 g/min离心5 min，取上清液，用BCA法进行蛋白定量。根据蛋白定量结果加入总蛋白样品和上样缓冲液，煮沸5 min，然后在12％分离胶/5％积层胶上进行电泳，用电转仪将凝胶上分离到的蛋白转移到PVDF膜上，5％BCA封闭2 h，用兔抗鼠Akt和p-Akt单克隆抗体（稀释度1：10 000，ABCAM公司，美国）4 ℃孵育过夜，次日用HRP标记的羊抗兔二抗（稀释度1：5000，武汉博士德生物工程有限公司）孵育2 h，加ECL发光液显影。采用凝胶成像系统进行分析，以目的蛋白条带灰度值和GAPDH条带灰度值的比值反映Akt和p-Akt蛋白的表达。

1.7 统计学处理 采用SPSS 17.0统计学软件进行分析，计量资料以（±s）表示，多组均数及组间两两比较采用单因素方差分析和最小显著差异法（LSD法），非糖尿病大鼠和糖尿病大鼠各指标的比较采用配对t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 非糖尿病大鼠与糖尿病大鼠体重和血糖的比较 与非糖尿病大鼠比较，糖尿病大鼠进食、进水和尿量均明显增加，毛发发黄易脱落，体重下降，血糖明显升高（P＜0.05），见表1。

表1 非糖尿病大鼠与糖尿病大鼠体重和血糖的比较（±s）

表1 非糖尿病大鼠与糖尿病大鼠体重和血糖的比较（±s）

*与非糖尿病大鼠比较，P＜0.05

种类体重（g）血糖（mmol/L）非糖尿病大鼠（n=24）368±12 5.6±0.8糖尿病大鼠（n=24） 316±24*22.4±3.6*

2.2 各组大鼠血cTnI浓度和AI的比较 非糖尿病大鼠中：与NDM-S组相比较，NDM-I/R组、NDMSP组和NDM-SP+W组血浆中cTnI的浓度、心肌细胞的AI均升高（P＜0.05）；与NDM-I/R组比较，NDM-SP组血浆中cTnI的浓度、心肌细胞的AI均降低（P＜0.05），NDM-SP+W组血浆中cTnI的浓度、心肌细胞的AI差异无统计学意义（P＞0.05）；与NDMSP组相比较，NDM-SP+W组cTnI的浓度、心肌细胞的AI均升高（P＜0.05）。糖尿大鼠中：与DM-S组相比较，DM-I/R组、DM-SP组和DM-SP+W组血浆中cTnI的浓度、心肌细胞的AI均升高（P＜0.05）；DM-I/R组、DM-SP组、DM-SP+W组之间cTnI的浓度、心肌细胞的AI两两比较差异无统计学意义（P＞0.05）。与NDM-SP组相比较，DM-SP组cTnI的浓度、心肌细胞的AI均升高（P＜0.05）。见表2。

表2 各组大鼠血cTnI浓度和AI的比较（±s）

表2 各组大鼠血cTnI浓度和AI的比较（±s）

*与NDM-S组相比较，P＜0.05；△与NDM-SP组相比较，P＜0.05；#与DM-S组相比较，P＜0.05

组别cTnI（μg/L）AI（％）NDM-S组（n=6）0.35±0.08 7.0±1.4 NDM-I/R组（n=6）1.14±0.16*△35.2±2.3*△NDM-SP组（n=6）0.73±0.52*24.2±2.1*NDM-SP+W组（n=6）1.12±0.41*△34.8±2.5*△DM-S组（n=6）0.42±0.09 7.2±1.7 DM-I/R组（n=6）1.18±0.38#35.9±2.2#DM-SP组（n=6）1.20±0.42△#36.6±2.3△#DM-SP+W组（n=6）1.21±0.29#36.2±1.9#

2.3 各组大鼠心肌Akt、p-Akt表达水平的比较 各组大鼠心肌组织中Akt的表达差异无统计学意义（P＞0.05）。非糖尿病大鼠中：与NDM-S组相比较，NDM-I/R组、NDM-SP组和NDM-SP+W组心肌组织中p-Akt的表达增加（P＜0.05）；与NDM-I/R组相比较，NDM-SP组心肌组织中p-Akt的表达增加（P＜0.05），NDMSP+W组心肌组织中p-Akt的表达差异无统计学意义（P＞0.05）；与NDM-SP组相比较，NDM-SP+W组心肌组织中p-Akt的表达减少（P＜0.05）。糖尿病大鼠中：与DM-S组相比较，DM-I/R组、DM-SP组和DM-SP+W组心肌组织中p-Akt的表达增加（P＜0.05）；DM-I/R组、DM-SP组、DM-SP+W组之间p-Akt的表达两两比较差异无统计学意义（P＞0.05）。与NDM-SP组相比较，DM-SP组心肌组织中p-Akt的表达减少（P＜0.05）。见表3、图1～3。

表3 各组大鼠心肌Akt、p-Akt表达水平的比较（±s）

表3 各组大鼠心肌Akt、p-Akt表达水平的比较（±s）

*与NDM-S组相比较，P＜0.05；△与NDM-SP组相比较，P＜0.05；#与DM-S组相比较，P＜0.05

组别Aktp-Akt NDM-S组（n=6）0.85±0.210.615±0.006 NDM-I/R组（n=6）0.79±0.250.859±0.006*△NDM-SP组（n=6）0.76±0.231.052±0.005*NDM-SP+W组（n=6）0.81±0.240.856±0.005*△DM-S组（n=6）0.78±0.220.622±0.003 DM-I/R组（n=6）0.83±0.190.860±0.004#DM-SP组（n=6）0.80±0.230.856±0.005△#DM-SP+W组（n=6）0.79±0.200.863±0.006#

图1 Akt蛋白浓度表达

图2 p-Akt蛋白浓度表达

图3 GAPDH蛋白浓度表达

3 讨论

研究认为，围术期糖尿病患者心脏危险事件发生率在50％以上，其麻醉和手术风险是非糖尿病患者2～3倍[6]。糖尿病患者行心脏外科手术发生心肌缺血再灌注损伤的后果更为严重，预后很差。因此探讨如何减轻糖尿病患者的心肌缺血再灌注损伤显得尤为重要。本研究参照文献[7-8]确定舒芬太尼和渥曼青霉素的给药时间及剂量。

PI3K-Akt信号转导通路参与了细胞许多的生理过程，包括调节细胞分裂、分化和凋亡等活动，是生命活动中的关键信号分子。PI3K可磷酸化肌醇环上的3位羟基，生成三磷酸磷脂酰肌醇，三磷酸磷脂酰肌醇作为第二信使，使Akt磷酸化后激活，活化后的Akt（p-Akt）可激活eNOS，eNOS是生成NO的限速酶，是PI3K-Akt信号转导通路的重要下游效应分子。p-Akt通过激活eNOS，促进心肌细胞合成NO，NO可减少线粒体通透性转化孔开放（MPTP）[9]。MPTP被认为是心肌保护作用的关键通道，MPTP开放后线粒体内促凋亡物质细胞色素C（CytC）和凋亡诱导因子（AIF）释放至胞质中，分别通过不同途径诱导细胞凋亡。因此减少MPTP的开放可以起到减轻心肌缺血再灌注损伤的作用[10]。研究显示，PI3K-Akt信号转导通路介导了人参皂苷Rb1预处理减轻糖尿病大鼠心肌缺血再灌注损伤的过程[11]。

本研究结果表明，除了DM-S组和NDM-S组外，其他组大鼠心肌缺血后，心电图ST段抬高呈弓背向上型，T波高耸，再灌注后血清中cTnI的浓度升高。cTnI增高可作为心肌损害的重要证据[12]，提示大鼠心肌缺血再灌注模型制备成功。与DM-S组和NDM-S组相比较，其余各组p-Akt表达增加，提示心肌缺血再灌注损伤与PI3K-Akt通路有关。舒芬太尼后处理能够减轻非糖尿病大鼠心肌缺血再灌注损伤，使血浆中cTnI的浓度降低、AI降低、p-Akt的表达增加。给予PI3K拮抗剂渥曼青霉素后，其保护作用消失，提示PI3K-Akt通路介导了舒芬太尼后处理对非糖尿病大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用。糖尿病大鼠在给予舒芬太尼后处理，上述指标未见明显改变，提示舒芬太尼后处理对糖尿病大鼠心肌缺血再灌注损伤没有保护作用，PI3K-Akt通路不参与该过程。研究表明糖尿病因素可通过影响糖原合酶激酶-3β（GSK-3β）上游多条信号通路的磷酸化水平来减弱吗啡后处理的心肌保护作用[13]。因此推断糖尿病因素可能是通过GSK-3β的蛋白磷酸化水平阻碍了舒芬太尼后处理对心肌缺血再灌注损伤的保护作用。心肌缺血再灌注损伤程度与2型糖尿病的病程有关，病程越长，心肌损伤越严重[14]。另外本实验选择的舒芬太尼给药量对于2型糖尿病大鼠的心肌缺血再灌注损伤来说剂量可能不够。所以，舒芬太尼后处理对非糖尿病大鼠和糖尿病大鼠心肌缺血再灌注损伤产生的不同影响及其机制还有待后期进一步的研究。

综上所述，舒芬太尼后处理对2型糖尿病大鼠心肌缺血再灌注损伤没有保护作用，PI3K-Akt通路不参与该过程。

[1]黎路平.冠心病合并糖尿病患者冠状动脉病变特点分析[J].中外医学研究，2012，10（25）：141-142.

[2]张红，刘金玲.舒芬太尼麻醉用于心血管手术的多种临床研究[J].中国医学创新，2013，10（13）：56-58.

[3]李靖，王建刚，田首元，等.PI3K-Akt信号转导通路在舒芬太尼后处理减轻大鼠心肌缺血再灌注损伤中的作用[J].中国药物与临床，2014，14（4）：444-446.

[4] Shinohara K，Viswanad B，Asrat L，et al.Combination of high-fat diet-fed and low-dose streptozotocin-treated rat：a model for type 2 diabetes and pharmacological screeing[J].Pharmacol Res，2005，52（4）：1307-1315.

[5]隋海静，邓琳，杨雪，等.丙泊酚对2型糖尿病大鼠心肌缺血-再灌注损伤的影响[J].临床麻醉学杂志，2012，28（1）：74-76.

[6]陈政文，张玲.糖尿病患者非心脏手术围术期心血管事件危险因素分析[J].临床麻醉学杂志，2012，28（11）：1070-1072.

[7]于静，郁丽娜，张冯江，等.舒芬太尼后处理和七氟醚后处理对大鼠离体心脏缺血再灌注损伤的影响[J].中华麻醉学杂志，2010，30（9）：1069-1073.

[8] Shinohara T，Takahashi N，Ooie T，et al.Phosphatidylinositol 3-kinase-dependent activation of akt，an essential signal for hyperthermia-induced heat-shock 72，is attenuated in streptozotocininduced diabetic heart[J].Diabetes，2006，55（5）：1307-1315.

[9] Balligand J L，Feron O，Dessy C.eNOS activation by physical forces： from short-term regulation of contraction to chronic remodeling of cardiovascular tissues[J].Physiol Rev，2009，89（2）：481-534.

[10]吴云，顾而伟，方卫平，等.舒芬太尼后处理对在体大鼠心肌缺血再灌注损伤的影响[J].安徽医科大学学报，2011，46（7）：652-655.

[11]吴洋，夏中元，赵博，等.PI3K/Akt信号转导通路在人参皂甙Rb1预先给药减轻糖尿病大鼠心肌缺血再灌注损伤中的作用[J].中华麻醉学杂志，2012，32（3）：358-360.

[12]李佳，王芾，林艺，等.心脏肌钙蛋白I与肌红蛋白比值诊断急性心肌梗死[J].中国医学创新，2012，9（7）：3-6.

[13] Cross E R，Hsu A K，Gross G J.Diabetes abolishes morphineinduced cardioprotection via multiple pathways upstream of glycogen synthase kinase-3β[J].Diabetes，2007，56（1）：127-136.

[14] Friehs I，Del Nido P J.Increased susceptibility of hypertrophied hearts to ischemic injury[J].Ann Thorac Surg，2003，75（2）：678-684.

The Effect on Type Ⅱ Diabetes Mellitus of the Myocardial Ischemia-Reperfusion Injury by Sufentanil Postconditioning in Rats and its Relation with PI3K-Akt Pathway

REN Qiang，WANG J ian-gang，TIAN Shou-yuan.//Medical Innovation of China，2015，12（09）：016-020

Objective：To investigate the effect on type Ⅱ diabetes mellitus of the myocardial ischemia-reperfusion injury by sufentanil postconditioning in rats and its relation with PI3K-Akt. Method：24 healthy male SD rats weighing from 180-200 g were randomly divided into 4 groups by random number table method （n=6）： nondiabetic mellitus sham operation group （NDM-S group）， nondiabetic mellitus ischemia-reperfusion group （NDM-I/R group）， nondiabetic mellitus sufentanil postconditioning group （NDM-SP group） and nondiabetic mellitus sufentanil postconditioning + wortmannin （PI3K-inhibitor） group （NDM-SP+W group）. More healthy male SD rats were made into T2DM model（Glucose≥16.7 mmol/L） by the following method： feeding them with high-sugar and high-fat diet for 6 weeks to induce insulin resistance and giving intraperitoneal injection of streptozotocin with the dosage of 35 mg/kg. Selected 24 rats that were successfully molded and keeping on feeding them with high-sugar and high-fat diet for 2 more weeks. to They were divided into 4 groups （n=6） by random number table method： diabetic mellitus sham operation group （DM-S group），diabetic mellitus ischemia-reperfusion group （DM-I/R group）， diabetic mellitus sufentanil postconditioning group （DMSP group） and diabetic mellitus sufentanil postconditioning + wortmannin group （DM-SP+W group）. The model of ratswith myocardium ischemic reperfusion was made by the following method： carrying out threading or ligation below the left anterior descending branch of coronary artery， blocking for 30 min and giving reperfusion for 120 min. But threading can only be carried out for the sham operation groups. After 5 min’s stabilization of the ischemia-reperfusion groups， it should be blocked for 30min and reperfused for 120 min. For sufentanil postconditioning groups， sublingual IV injection of 1.0 μg/kg sufentanil was given 5 min before the reperfusion， while sublingual IV injection of 15 μg/kg wortmannin and 1.0 μg/kg sufentanil were given for the sufentanil postconditioning + wortmannin groups. Blood sample was taken after 120 min’s reperfusion to check the cTnI level. Myocardial tissues were collected after rats’ death to check the AI of cardiomyocytes by TUNEL method and the Akt， p-Akt level of myocardial tissues by Western blot method.Result：Compared I/R， SP and SP+W groups with S group of both NDM and DM rats， the cTnI level in plasma of the former groups was obviously elevated， as well as increased AI and p-Akt level（P＜0.05）. Sufentanil postconditioning could obviously reduce the MI/RI of NDM group， which could lower the cTnI and AI level and increase the p-Akt level（P＜0.05）， but it had no obvious effect on the MI/RI of DM group. The cTnI level in plasma and AI of the NDM-SP group were obviously lower than the DM-SP group， while the p-Akt level of former group is higher than the latter.Conclusion：Sufentanil postconditioning has no protective effect on type Ⅱ diabetes mellitus against myocardial ischemia-reperfusion injury in rats and PI3K-Akt pathway is not involved in this process.

Sufentanil postconditioning； Type Ⅱ diabetes mellitus； Myocardial ischemia-reperfusion injury； PI3K-Akt

10.3969/j.issn.1674-4985.2015.09.006

2014-08-04） （本文编辑：蔡元元）

山西省自然科学基金（2013011049-2）

①山西医科大学麻醉学系 山西 太原 030001

②山西医科大学第一临床医学院

王建刚

First-author’s address：Shanxi Medical University Department of Anesthesia，Taiyuan 030001，China