调节性T细胞及其细胞因子在弱精子症患者的表达与临床意义

蔡海鹏林宝东黄厚沐

调节性T细胞及其细胞因子在弱精子症患者的表达与临床意义

蔡海鹏①林宝东①黄厚沐①

目的：观察CD4+CD25+调节性T细胞（Treg）在弱精症不育患者变化规律以及与精子质量的相关性。方法：收集60例弱精症不育患者为观察组及36例健康志愿者为对照组，收集其外周血及前列腺液标本，采用流式细胞术检测外周血及前列腺液内（Treg）及其胞内转化生长因子β1（TGF-β1）及白介素10（IL-10）含量，并分析以上三者与精子活力及活率的相关性。结果：观察组患者外周血及前列腺按摩液Treg、IL-10及TGF-β1均显著低对照组（P＜0.05）；Treg与精子密度、活力及性激素水平之间均呈正相关性（r＞0.075，P＜0.05）。两组精液量比较差异无统计学意义（P＞0.05），观察组精子活率、运动速度和ATP含量指标均显著低于对照组，两组比较差异有统计学意义（P＜0.05）；经Pearson检验，CD4+CD25+Treg、TGF-β1和IL-10与精子活率、畸形率、运动速度、精子ATP指标之间均呈正相关性。结论：CD4+CD25+Treg免疫异常所致的精子的免疫性破坏过度，可能是弱精症不育症的重要免疫学机制。

调节性T细胞； 弱精症； 免疫破坏； 免疫抑制细胞因子

近年报道弱精症导致不育的案例越来越多，该类患者甚至连慢性前列腺炎的病史都不具备，其机制不明，因此给治疗带来困难。有研究表明免疫因素可能是弱精症的重要发病机制[1]。国外有报道CD4+CD25+调节性T细胞（Treg）与不育症相关，但目前国内关于弱精症患者Treg变化的研究不多。因此笔者以此为切入点，重点观察了弱精症与健康成年男性外周血Treg及血常规的变化，发现弱精症患者Treg数量明显降低，且与Treg功能密切相关的细胞因子IL-10及TGF-β1亦表现为数量不足。

1 资料与方法

1.1 一般资料 本研究以2013年1月-2014年12月本院泌尿外科门诊及病房接诊的60例弱精子症患者为观察组，平均年龄（35.3±9.3）岁，平均病程（5.6±1.5）年。入选标准如下：所有患者均为婚后性生活正常，未采取任何避孕措施而不育1年以上，女方生育力检查正常，男方无生殖系统发育异常、无生殖系统感染、无精索静脉曲张、精道梗阻、逆行射精或不射精等疾病；精液参数中前向运动的精子（a和b级）＜50％或a级运动的精子＜25％的异常情况。36例健康志愿者来自本院体检中心为对照组，平均年龄（32.7±11.5）岁，经健康体检已排除泌尿生殖系统及其他疾病[2-3]。以上观察对象均同意静脉抽血及前列腺按摩检查，两组的一般资料比较差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。

1.2 实验材料 鼠抗人CD4-FITC单抗，CD25-PE单抗及同型对照IgGI-FITC，IgG -PE，均为B&D公司产品。流式细胞仪为Beckman公司产品（型号：EPICSXL）。IL-10及人TGF-β1的血清及前列腺液ELISA试剂盒购自南京建成生物工程研究所。淋巴细胞分离液（AXIS-SHIELD公司）、RT-PCR试剂盒及Tregizol RNA提取试剂盒均购自武汉博士得生物科技有限公司，PE9600型PCR扩增仪（美国PE公司）[2]。

1.3 标本采集 外周血：清晨采集以上观察对象的静脉血约2.0 mL，采用肝素钠抗凝；精液：采用手淫法采集精子约1～3 mL，采用肝素钠抗凝；前列腺液：采用前列腺按摩法，采集前列腺液约0.5～1.0 mL，采用肝素钠抗凝[4-7]。

1.4 检测方法 外周血：采用淋巴细胞分离液常规分离外周血单个核细胞（PBMC），用含10％小牛血清的RPMI-1640调细胞至106/mL，取200 μL细胞分别加入抗CD4-FITC、抗CD25-PE的单克隆抗体各20 μL，同型对照分别为IgG1-FITC、IgG-1-PE，混匀后避光孵育25～30 min，PBS洗涤2次。将细胞悬浮于0.5 mL PBS洗涤液中，振荡混匀后上机检测[3]。同法检测前列腺液及外周血IL-10、及TGF-β1的含量。精液：使用精子质量分析仪检测存活率、平均运动速度、精子活力指数等指标。

1.5 统计学处理 运用统计软件包SAS 8.1对本研究数据进行统计，计量资料采用（±s）表示，符合正态分布及方差齐者采用t检验比较组间差异，不符合正态分布者采用秩和检验，指标之间的相关性分析采用Pearson参数法，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组患者Treg及细胞因子比较 观察组患者外周血CD4+CD25+Treg、外周血及前列腺液的TGF-β1和IL-10均显著低于对照组，两组比较差异有统计学意义（P＜0.05），见表1。在CD4+CD25+Treg的基因表达含量方面，两组的Foxp3有差异。组间比较显示，两组患者的外周血及前列腺液IL-10及TGF-β1差异有统计学意义（P＜0.05），见表1。

表1 两组患者Treg及细胞因子比较（±s） ％

表1 两组患者Treg及细胞因子比较（±s） ％

TGF-β1组别TregIL-10外周血前列腺液外周血前列腺液观察组（n=60）2.72±0.332.38±0.681.81±0.223.61±1.832.76±1.03对照组（n=36）5.18±0.973.92±1.192.21±1.345.92±2.914.65±0.82 t值-2.393-5.121-2.732-3.526-2.887 P值0.0260.0250.0060.0030.005

2.2 两组精液常规比较 两组精液量比较差异无统计学意义（P＞0.05）；观察组精子活率、运动速度和ATP含量指标均显著低于对照组，两组比较差异均有统计学意义（P＜0.05），见表2。

表2 两组精液常规比较（±s）

表2 两组精液常规比较（±s）

*与对照组比较，P＜0.05

组别精液量（mL）活率（％）运动速度（μmol/s）ATP（μmol/dL）观察组（n=60）2.38±0.41 35.41±14.28*15.83±4.42*3.45±1.98*对照组（n=36）2.52±0.3562.28±13.5534.66±2.947.03±2.49

2.3 相关性分析 经Pearson检验，CD4+CD25+Treg、TGF-β1和IL-10与精子活率、畸形率、运动速度、精子ATP指标之间均呈正相关性（r＞0.075，P＜0.05）。

3 讨论

弱精子症占所有男性不育致病因素的半数以上，引发弱精子症的原因很多，主要有生殖道感染、免疫因素、精索静脉曲张、内分泌因素以及先天性疾病等[4-9]。目前弱精子症的免疫发病机制尚未明确，是其治疗效果欠佳的主要原因之一。Treg细胞是近年发现的一群具有独特免疫调节作用的抑制性T细胞[4]。本研究从T细胞免疫学角度研究弱精子症患者调节性T细胞及其细胞因子的表达，总结弱精子症患者Treg及其细胞因子的变化规律，以及弱精子症患者CD4+CD25+Treg及其细胞因子含量与精子质量的相关性[10]。研究结果表明，观察组外周血CD4+CD25+Treg的含量显著低于对照组，外周血的TGF-β1和IL-10显著低于对照组；观察组前列腺液的TGF-β1和IL-10显著低于对照组；外周血的TGF-β1和IL-10均显著高于前列腺液；两组精液量比较差异无显著性；观察组精子活率、运动速度和ATP含量指标均显著低于对照组；经Pearson检验，CD4+CD25+Treg、TGF-β1和IL-10与精子活率、畸形率、运动速度、精子ATP指标之间均呈正相关性。

CD4+CD25+Treg在前列腺的免疫失衡中起到重要作用[11]。Treg活化后不仅能抑制CD4+和CD8+T细胞的活化和增殖，还可抑制组织内由于T细胞免疫杀伤过度所致的免疫性损伤，因此Treg具有下调及抑制免疫的功能[12]。Foxp3是一个重要的蛋白，其可促使初始（未成熟）T细胞向Treg转化，因此Foxp3是Treg的主要功能因子，前者的减少可导致Treg功能的缺陷[5]。在Treg所分泌的细胞因子中，IL-10与TGF-β1所占的位置最为重要：TGF-β1可促进Foxp3基因的克隆表达，而后者是发挥免疫抑制功能的主要功能因子[13-14]。除TGF-β1外，作为白介素家族重要成员的IL-10，具有抑制炎性反应、预防自身免疫现象出现的生物学作用，因此缺乏IL-10可导致一系列自身免疫病如肠炎或脑脊髓膜炎（EAE）的发生[15]。

本文以上述背景为理论依据，从免疫调节的角度观察弱精症的发病机制，通过直接检测外周血Treg数量发现该T细胞在弱精症患者的表达明显降低，且发现外周血及前列腺液当中该细胞的功能因子TGF-β1及IL-10均显著降低，这进一步印证了不论在全身抑或前列腺组织局部，都表现为Treg数量的减少及功能的不足。其原因可能是：弱精症患者降低使IL-10不足以抑制单核细胞的活化与增值，导致单核细胞过度执行抗原提呈功能，后者致使外周血及前列腺局部的免疫反应过强，使前列腺导管和腺泡不断受到免疫损害而导致生精功能减退等临床表现[14]。

综上所述，对于弱精子症患者而言，CD4+CD25+Treg含量和功能的异常，导致TGF-β1和IL-10细胞因子减少进而引发免疫抑制功能下降，导致了前列腺的免疫反应过强产生了抗精子抗体，影响精子的活动能力、运动能力以及穿透能力。因此，CD4+CD25+Treg免疫异常是弱精子症发病的重要影响因素。

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Expression and Clinical Significance of Regulatory T Cells and Cytokines in the Asthenospermia

CAI Haipeng，LIN Bao-dong，HUANG Hou-mu.//Medical Innovation of China，2015，12（09）：027-029

Objective： To observe the change pattern of CD4+CD25+regulatory T cells （Treg） in asthenospermia infertile patients and the correlation with sperm quality.Method： The peripheral blood and prostatic fluid specimens were collected from 60 asthenospermia infertile patients as the observation group and 36 healthy volunteers as the control group. The flow cytometry was used to determine the volume of Treg， intracellular transforming growth factor β1 （TGF-β1）and interleukin 10 （IL-10） in the peripheral blood and prostatic fluid.The correlation of the above three substances of sperm viability and motility rate were analysed.Result：Compared with control group，the observation group patients of Treg， IL-10 and TGF-β1 asthenospermia infertile had significantly lower volume in their peripheral blood and prostate massage fluid，the differences were statistically significant（P＜0.05）.There was positive correlation between Treg and sperm density， vitality and sex hormone levels separately（r＞0.075，P＜0.05）.There was no significant difference in the sperm volume of the two groups. The sperm motility rate， sperm velocity and ATP of the observation group were all obviously lower than those of the control group， the difference was statistically significant（P＜0.05）. The Pearson method was used， CD4+CD25+Treg，TGF-β1 and IL-10 had positive correlation with the index of sperm motility rate，malformation，velocity，and ATP.Conclusion：The dysimmunity of CD4+CD25+Treg， which causes excessive damage to the sperm immunity， is possibly an important immunological mechanism of the asthenospermia infertility.

Regulatory T cells； Asthenospermia； Immunity damage； Immunosuppressive cytokines

10.3969/j.issn.1674-4985.2015.09.009

2015-01-13） （本文编辑：周亚杰）

①广东省汕头市潮阳区大峰医院 广东 汕头 515100

林宝东

First-author’s address：Shantou Chaoyang District Dafeng Hospital，Shantou 515100，China