基质金属蛋白酶－28的研究进展

黄 震 张长春 朱 坤 许 刚

基质金属蛋白酶(matrixmetalloproteinases，MMPs)因其主要依赖金属离子而得名。该酶作用广泛，在降解细胞外基质(extracellularmatrix，ECM)、细胞生长、促进新生血管形成等，且广泛参与人体病理生理过程。该家族的成员MMP－28在某些肿瘤、炎症过程有报道，且发现对于某些疾病的诊断及治疗具有意义。本文对MMP－28的结构、生理功能及与疾病关系进行了综述。

1 MMPs家族生物学性质

1.1 MMPs功能及分类 MMPs是其内部构成中含有Zn2+、Ca2+的一类蛋白水解酶家族。在自然界进化中属于高度保守的一类酶，较为广泛的分布于动植物中，是降解细胞外基质(ECM)过程中非常重要的一类酶。能降解细胞外基质中的膜型基质金属蛋白酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ，间质溶素1、2，胶原酶，明胶酶A、B等。而且基质蛋白酶及相对应抑制剂共同参与维持ECM动态平衡。该类酶还广泛参与在人体多种组织中的生理及病理过程。比如炎症发生过程、胚胎的生成、免疫应答、血管的组成、肿瘤侵袭及转移、心血管疾病、类风湿性关节炎等［1－7］。

Gross与Lapiere在1962年第1次报道出了基质蛋白酶－胶原酶，作用于ECM不同类别的基质金属蛋白酶相继被报道研究。到目前为止已发现及研究的MMPs家族成员至少可分为5大类28种［8］，并根据不同的分子结构及功能作用去归类分型。其可分为5大类［9］:明胶酶(gelatinase)，间质性胶原酶(interstitial collagenase)，膜型金属蛋白酶(memberane－type matrix metalloproteinases，MT－MMPs)，间质溶素(stromelysin)与其它类，这些未归类MMPs的作用比较特殊，在其分类中缺少明显的特征，不能以其分子结构和相对底物特异性去归于MMPs已明确的种类之中，而MMP－28就属于其他类中的一员。

1.2 MMPs结构特点 MMPs成员具有部分结构类似的结构域以及氨基酸序列，特点如信号肽与前肽区［10］:信号肽约20个氨基酸残基共同参与组成，其作用是促进引导翻译后的产物，使该产物转移至胞浆内质网中。前肽区约80个氨基酸残基所构成，该区的裂解主要作用于基质金属蛋白酶的激活过程中。且前肽区内含有一个高度保守的 Pro－Arg－Cys－Gly－Val/Asn－Pro－Asp(PRCGV/NPD)序列，该序列的半胱氨酸残基可与催化区内的锌离子互相结合，从而维持酶原的结构及功能稳定，其在大多数MMPs中酶原的活化中具有非常重要的作用。

1.3 MMPs抑制剂 MMPs的抑制剂主要分为两大类:一类为其天然组织抑制因子(tissue inhibitor ofmatrixmetalloproteinases，TIMPs)［11］，TIMPs 与 MMPs 的酶原相互结合形成较为稳定的复合体，从而阻碍抑制酶原活化;TIMPs还可直接与活化后的MMPs按照1:1比例相互结合，从而抑制酶的活性。从而证明TIMPs参与维持ECM在内环境中的动态平衡，也与组织重塑、个体发育、细胞生长分化等相关生理及病理过程关系密切;另一类为抑制剂，血浆抑制剂包括α2－巨球蛋白、β1－抗胶原酶、α－抗胰蛋白酶、正电性糖蛋白;络合剂EDTA和部分人工合成含硫多肽衍生物也可抑制MMPs的活性。

2 MMP-28的来源及结构

2.1 MMP－28来源 MMP－28 是 MMPs近年来的一个新成员，2001年由Lohi等［12］自人角化上皮及睾丸的cDNA文库中克隆而来。MMP－28与目前已知的MMPs其余成员的同源相似性较低。从生物学功能作用及结构等方面上来看，它与 MMP－19有39%同源相似性，从而推断出MMP－28属于 MMP－19亚族，相对分子量为59 kDa，长3.0 kb，可编码520个氨基酸序列。

2.2 MMP－28功能及结构 MMP－28与 MMPs其他成员一样，具有可降解基质的生物学功能。MMP－28与MMPs中别的成员相比，在构成及生化功能上具有相似性，但是也有着明显的不同。从MMP－28的结构域特点来看，含有 PRCGVTD序列的前肽结构域、HEIGHTLGLTH序列的锌离子结合的催化结构域以及血红素样结构域［12－13］，这些结构域在MMPs成员中普遍存在。MMP－28另外还具有一个独特的弗林蛋白酶激活序列(furin activation sequence)RRKKR，但其结构中并无跨膜序列［14］。目前发现 MMP－11 和 MMP－19 同样具有弗林蛋白酶激活序列剪切位点，因而可得出激素前质蛋白转化酶家族具有剪切 MMP－28的作用。MMP－28在外显子、内含子的组合构成及剪接位点形式上与MMPs其他成员也有着明显的不同之处。MMPs基因中一般含有10个外显子，但是在MMP－28基因中仅仅含有8个外显子，而且其中5个外显子的剪切位点不能被其他的MMPs所结合使用。在第4外显子通过选择剪切形式转录，但是它并不能编码其催化结构域的N端。由启动子分析研究显示得出，一些细胞的基本表达产物中具有MMP－28，它的调控作用与其他MMPs也有所不同。MMP－28启动子的结构及功能同样具有特异性，在其转录起始位点无CCAAT或TATAbox序列，且结构上具有特异的“半胱氨酸开关”。Illman等［15］通过基因检测实验从人的基因组中成功分离出长为3.0 kb的MMP－28的基因，并包含有5'－侧翼序列，且 TATA box或 CCAAT 序列不在 5'－侧翼序列的转录起始点。从而证实在人类的MMP－28基因之中具有两个不同的转录起始点，一个转录起始点位于转录起始点上游210 bp，另一个位于转录起始点上游230 bp处。其启动子需依赖结合Sp家族转录因子中的GT－box序列，并且Sp家族成员具有同源相似性，其位于转录结合起始位点上游300 bp处。通过小鼠实验得出，人类的该转录位点和小鼠是具有高度同步保守的，且该序列位点的缺失及突变等都会使转录活性受到影响。通过凝胶迁移率变动分析检测相关蛋白与该转录位点结合，使其形成特异性蛋白核酸结合物，使用特异性抗体检测表明该蛋白核酸结合物的组成成分中含有Sp1和Sp3，因此，MMP－28基因可能受此调控机制影响。Illman等［16］在编码第7个外显子中血红素样结构域起始处时，检测到 MMP－28 mRNA剪切有两种不同形式，分别为缺少30 nt和70 nt。通过克隆小鼠MMP－28的cDNA，进行序列测定证实，人类与小鼠的MMP－28氨基酸序列同源性高达85%，而且前结构域中都含有高度保守的特征如 RKKR弗林蛋白酶激活序列。其包含有两个分别编码41和39个氨基酸，是与人类相关的插入序列，而人类中的isoform 1序列编码520个氨基酸和isoform 2序列编码393个氨基酸。

3 MMP-28与疾病关系

3.1 MMP－28表达 MMP－28高表达于人的基底部皮肤、基底上部角质细胞以及睾丸的精子细胞、神经发育等过程中［17，18］，在心、肺、脑、肾、肠道、椎间盘、骨骼肌、胎盘、前列腺及某些肿瘤细胞系中同样有着MMP－28群体的存在。该类酶涉及了人体多种生理及病理过程，如炎症、胚胎发生、血管形成、肿瘤侵袭转移等。

3.2 MMP－28 与创伤愈合 MMP－28 与创伤愈合

MMP－28的表达参与促进创伤愈合及维持组织内环境稳态［19，20］，共同参与基底膜重建过程。lllman 等［19］通过实验证实，MMP－28经由TGF－β依赖机制诱导上皮细胞－间充质细胞转化(epithelial－mesenchymal transitions，EMT)的发生和细胞侵袭，从而说明该酶参与介导肿瘤发生和调节上皮细胞功能。Saarialho－Kere等［21］研究得出，在急、慢性伤口远端由有丝分裂Ki－67阳性角质细胞可以产生出MMP－28，它一般情况下不与另外3种酶，基质降解酶2、胶原酶I和92 kDa的明胶酶共同存在。MMP－28可在大水疱和溃疡型肉芽肿等上皮组织损伤表达，但是在正常皮肤组织和棘皮症组织中则未检测到表达。在受到损伤的皮肤组织内，MMP－28则明显表达于距离伤口较远端的基底部角质形成细胞中，该种损伤修复方式与MMPs其他成员不同。另有研究表明MMP－28并不产生在发育正常伤疤组织中，但是在肥大性伤疤中则具有表达活动。而且MMP－28不在牛皮癣和扁平苔藓等皮肤增生性疾病中表达［22］，从侧面验证了MMP－28参与基底膜的重建构成。但机体表皮中所表达的主要八聚体结合蛋白Skn－1a、Tst－1 及 Oct－1，对角质细胞中 MMP－28 表达并不具有调控作用。

3.3 MMP－28与肿瘤扩散 癌转移扩散是导致癌症患者死亡的主要原因。癌的转移扩散是一个由一系列步骤组成的较为复杂过程，主要过程是细胞黏附能力的改变、肿瘤血管的生成、癌细胞的运动、癌细胞的定植、ECM的降解等。ECM动态平衡遭受破坏，降解增多是癌扩散转移过程中的重要一步。ECM中的成分如纤维连接蛋白(fibronectin，FN)、层黏连蛋白(laminin，LN)、IV型胶原等会受到癌细胞所分泌的蛋白水解酶(包括组织蛋白酶D、IV型胶原酶等)分解，使细胞基底膜受到破坏从而产生局部的缺损，让癌细胞得以通过。MMPs成员能降解ECM和基底膜中组成成分，破坏其局部组织稳定结构，从而增加肿瘤诱导中的所需血管形成。MMP－28的活性表达与肿瘤的侵袭、转移等有关。作为MMPs中的新成员，MMP－28可通过蛋白水解作用直接去作用于ECM，水解对应的酶及蛋白质，或与其他MMPs成员共同参与多种肿瘤的侵袭及转移过程。李付彪等［23］使用 RT－PCR方法检测对照肺良性病变组织与肺癌组织中MMP－28 mRNA表达水平，实验结果显示，肺癌组织中检测到的 MMP－28 mRNA表达水平明显高于肺良性病变组织及癌旁组织，且与P－TNM分期、细胞分化程度及淋巴结转移等密切有关。Overall等［24］研究证实MMPs在乳腺癌组织中的表达模式呈现为一种低水平表达，但是MMP－28在其中的表达较家族其他成员有明显增高。Jian等［25］通过使用逆转录－聚合酶链反应及免疫组化方法证实MMP－28在胃癌组织中的表达显著增高，表明MMP－28过度表达在胃癌疾病的进展中，并能促进肿瘤细胞的侵袭和转移。Bister等［26］通过 MMP－28 与MMP－19、MMP－26 对比研究证实，在结肠癌的扩散及转移侵润过程中，扮演了非常重要的作用。MMP－28在正常结肠组织有所表达，但是在炎症结肠组织中既不能表达于非转移性和转移性细胞，又不能在脱落的上皮组织中观察到，提示炎症和破坏性与MMP－28表达改变无关［27］。

3.4 MMP－28与椎间盘疾病 导致椎间盘退变的机制原因有许多种，如力学因素刺激、细胞外基质成分的变化［28］、营养代谢、细胞衰老凋亡、蛋白多糖聚合体的丢失、分解产物积累等，都能促进椎间盘的退变。在椎间盘组织中过量MMPs表达、椎间盘组织细胞活性降低和ECM分解合成平衡功能破坏，是造成椎间盘退变的重要原因。退变的椎间盘组织中可检测到绝大多数MMPs成员表达升高，如MMP－2在椎间盘退变的过程中分解胶原，从而使椎间盘生化性质的不稳定性，其不稳定性与退变又会影响到周围组织，引起蛋白裂解或纤维化导致脊柱的重塑。MMP－3的作用于基质中的蛋白多糖、糖蛋白等，还可以作用于裂解Ⅱ型胶原非螺旋区结构，并且可以激活其他MMPs成员，从而导致椎间盘退变［29］。而 Gruber等［30］研究得出 MMP－28 在退变椎间盘组织中呈现为阳性表达，证实椎间盘退变与MMP－28有相关性，是影响椎间盘退变的重要因素之一，但具体机制尚不清楚。

3.5 MMP－28与口腔疾病 口腔黏膜组织病变组织中，MMP－28的高表达于口腔扁平苔藓、口腔白斑组织，而在癌前病变白斑组织中的表达高于扁平苔藓组织，从侧面验证了 MMP－28可能参与癌变的发病过程［31］。Lin 等［32］利用免疫组织化学分析和 RT－PCR检测表明，口腔鳞状细胞癌(oral squamous cell carcinomas，OSCCs)中 MMP－28 mRNA 及蛋白表达水平明显高于口腔癌前病变及癌旁组织。在临床上，口腔肿瘤恶性程度转化可以以MMP－28为标志，但是在黑色素瘤早期病程发展中却不能够表达［33］。Padmavati等［34］使用RT－PCR方法对比检测正常牙龈组织、慢性牙周炎、侵袭性牙周炎组织中MMP－28的mRNA表达，证实出在正常牙龈组织表达要高于病变组织，从而说明MMP－28可作为牙周健康的一种生物标志物。

4 小结

由于MMP－28是MMPs中的新成员，所以国内外的相关报道相对较少，与其他MMPs成员相比，目前对MMP－28的研究只局限于其生化结构和相关肿瘤组织的表达，而明确的生理作用和特异底物尚属未知，仅仅有研究证明在体外MMP－28可裂解酪蛋白。与MMPs中较早被发现及重视研究的MMP－2、MMP－9等不同，MMP－28没有得到较广泛的研究，而且其在人体内的生物学功能、组织表达等也有待进一步的研究。通过对MMP－28的深入研究，相信该蛋白酶在不久的将来可以对多种疾病的预防及诊断具有潜在的指导意义。

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(2014－04－05收稿 2014－06－10修回)