八角莲愈伤组织和组培品及野生品中鬼臼毒素的HPLC分析

何军忠， 袁家代， 李 娅， 李 维， 段辉国， 何 兵*

(1.四川师范大学生命科学学院，四川成都610101;2.内江师范学院生命科学学院，四川内江641000)

八角莲(Dysosma versipellis(Hance)M.Cheng)隶属小檗科八角莲属，为我国特有的濒危药用保护植物.其分布零星，严格要求亚热带山地森林生境，常常局限生长在有机质丰富、酸性至中性(pH4.2 ～7.8)透水性好的土壤中［1］.其耐荫性的特性十分突出，对湿度的要求较高.主要分布于我国藏东南-川西-秦岭-淮河以南海拔300～1 500 m山区，已知湖北、湖南、河南、四川、江西、安徽、浙江、广东、广西、云南、贵州，山西诸省均有分布［2-3］.八角莲野外分布地区虽广，但种群数量不大，刘海华等对恩施土家族苗族自治州八角莲野生资源的分布及蕴藏量等方面进行实地调查，估算湖北产区的八角莲蕴藏量约为832.91 kg，其年允量为138.8 kg/a［4］.

八角莲生长缓慢，种子萌发的幼苗在5～6 a后才性成熟.随着人类活动范围的日益扩大，八角莲适宜的生境正在缩小，各种群之间呈现明显间断的“岛屿状”分布，且大种群越来越小，小种群迅速消失，甚至自然保护区内的种群也不能幸免［5-6］.各种群间基因的流动主要通过种子的传播，而且八角莲为异花授粉植物，自花授粉呈限制性结实，很少有虫媒，坐果率很低，制约了天然药物的进一步开发.其根茎入药，具有清热解毒、祛痰散结等功效［7-8］.现代医学中八角莲注射液用于治疗流行性出血热、乙型脑炎、腮腺炎、毒蛇咬伤及癌症等，特别用于食道癌和子宫癌的治疗［9］.药理研究表明，该属植物中含有鬼臼毒素，具有抗肿瘤、抗病毒以及免疫调节作用，为抗癌药VP-16和VM-26的原料［10］.

组织培养方面，兰小中等［11］进行了西藏八角莲组织培养条件的筛选，认为选用已经萌动的芽为外植体，6-BA和NAA的比例控制在1.8/0.2，同时加入5 g/L的活性炭为最佳培养条件.叶耀辉等［12］以八角莲的根茎、叶片为外植体，成功诱导八角莲的愈伤组织.唐凤鸾等［13］以八角莲种子为外植体，对八角莲进行组织培养研究.结果表明:种子易萌芽，并且可诱导种子幼苗形成丛生芽;继代繁殖在高浓度与低浓度BA或无BA的培养基上进行循环培养效果较好;带叶叶柄可诱导愈伤及根，直接形成再生植株.

八角莲的组织培养品与野生品所含化学成分类型基本相同，但有效成分鬼臼毒素的含量低于野生品［14-15］.组织培养技术能极大提高繁殖系数，同时该技术还具有脱毒和迅速更新品种等优点.本实验通过建立八角莲组培-移栽体系，并利用HPLC测定比较八角莲的愈伤组织和组培苗及野生植株中鬼臼毒素的含量，以期为八角莲的引种保护和资源开发利用奠定基础.

1 材料与试剂

1.1 研究对象 八角莲(Dysosma versipellis(Hance)M.Cheng)野生植株采摘于四川雅安碧峰峡境内，经四川师范大学何兵副教授鉴定移栽于四川师范大学生物园内.

1.2 主要仪器 日本岛津Essentia LC-15C高效液相色谱仪;日本岛津WondaSil C18色谱柱(4.6 mm×150 mm，5 μm);苏州安泰 SW-CJ-2F 型超净工作台;上海立德泰勀LT-ACC300型人工气候箱.

1.3 主要试剂 氯化高汞(HgCl2)、吐温T-80、无水乙醇、甲醇、琼脂、蔗糖、活性炭(AC)、6-苄基氨基酸腺嘌呤(6-BA)、2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)、苯基噻二唑基脲(TDZ)、激动素(KT)、α-萘乙酸(NAA)，甲醇为色谱纯，其他试剂均为分析纯，均购自成都市苌钲化玻有限公司.

2 方法

2.1 组织培养

2.1.1 培养条件 培养基均含有质量分数3%的蔗糖和7 g/L琼脂，pH为5.8～6.0.所有的培养基均经121℃，0.5 MPa消毒20 min.光照强度为1 000 lx，光照时间为16 h/d，培养温度(22±2)℃.

2.1.2 愈伤组织的诱导 取新鲜材料，冲洗干净后用质量分数75%的酒精漂洗20 s，然后用无菌水冲洗2次，再用质量分数0.15%的升汞溶液(加入2～3滴吐温T-80)消毒8 min，接着用无菌水冲洗4～5次，外植体消毒后用无菌滤纸吸干［16-17］.叶片切成约1 cm2小块，近轴面朝上接种培养基M1中;叶柄切成1 cm小段，形态学下端插入培养基M2中;根切成1 cm小段，水平接种到培养基M3中.接种后放到培养室培养观察，统计愈伤诱导率.

2.1.3 愈伤组织分化的诱导 将3种愈伤组织接种至培养基A(MS+6-BA 5.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L+AC 0.05%)上，培养15 d，转接至培养基B(MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L+AC 0.05%)上，每20 d继代一次，培养40 d左右，选择成功诱导芽分化的愈伤组织，接种至培养基C(1/2 MS+NAA 0.5 mg/L+AC 0.3%)上，放到培养室培养观察，统计愈伤分化率.

2.1.4 炼苗移栽 将已有芽分化的愈伤组织接种在培养基C上培养20～25 d，使无菌苗大量生根.当组培苗长至5 cm左右，根5～8条时，将组培苗放置于自然环境下封口炼苗7 d，再用镊子将苗从培养瓶中取出，用大量清水冲洗附在根部的培养基，移栽至珍珠岩与泥炭土混合(2∶1)的基质中，在苗上覆盖塑料薄膜，并每天对苗进行喷雾.每7 d左右浇灌喷洒适量MS营养液，炼苗60 d左右移栽到园林土中，统计移栽存活率.

2.2 愈伤组织、组培品和野生品中鬼臼毒素的含量测定

2.2.1 标准品溶液的制备 精密量取20 mg鬼臼毒素标准品(质量分数≧ 98%，批号:MUST-13062701)，用无水甲醇溶液溶解并定容至10 mL容量瓶，充分摇匀，即得质量浓度为2.0 mg/mL的标准品母液，然后利用梯度稀释法分别配制不同浓度(0.01、0.02、0.04、0.10、0.50、1.00 mg/mL)的鬼臼毒素标准品溶液.

2.2.2 供试品溶液的制备 将八角莲3种愈伤组织(叶愈伤、叶柄愈伤、根愈伤)，组培苗不同组织(叶、叶柄、根状茎、根)，野生品不同组织(叶、叶柄、根状茎、根)，放置在烘箱中，于110℃杀青15 min，于50℃下烘10 h以上至恒重，然后用研钵研磨成精细粉末，过80目筛.准确称取0.5 g粉末，置具塞锥形瓶内，精密加入质量分数80%甲醇10 mL，密塞，称重，冷浸6 h，超声处理1 h，放冷，称定重量，用质量分数80%甲醇补足损失的重量，摇匀，吸取上清液，于8 000 r/min下离心5 min，取上清液，经0.45 μm有机相滤膜的注射器过滤，即得供试品［18-20］.

2.2.3 HPLC色谱条件 岛津WondaSil C18色谱柱(4.6 mm ×150 mm，5 μm);流动相为甲醇 -水(50∶50，V/V);流速1 mL/min;检测波长为290 nm;柱温为35℃;进样量为20 μL.

2.2.4 线性关系的考察 取制备好的系列浓度的标准溶液，按2.2.3的HPLC色谱条件进样，以浓度为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)进行线性回归，计算回归方程.

2.2.5 含量测定 取制备的供试品和对照品溶液，按2.2.3的HPLC色谱条件进行测定，并计算供试品中鬼臼毒素的含量.

3 结果与分析

3.1 愈伤组织的形成 从表1可知，八角莲根和叶柄诱导的愈伤组织诱导率要高于叶，差异显著.根与叶柄的愈伤组织诱导率较接近.3者诱导所得的愈伤诱导率为:根＞叶柄＞叶.八角莲愈伤组织在继代过程中非常容易褐化，由伤口处分泌的酚类等有害物质，严重影响愈伤组织的继代增殖，适量的添加AC后，褐化现象得到明显的遏制(图1).

表1 不同外植体对八角莲愈伤组织的诱导率影响Table 1 Effects of different explants on callus induction rate of D.versipellis

3.2 愈伤组织分化的诱导 将3种诱导的愈伤组织接种至含高浓度细胞分裂素(6-BA)的培养基A中，培养15 d后转接至含低浓度细胞分裂素(6-BA)的培养基B中.培养15～20 d左右发现，由根诱导的愈伤组织在继代后生长缓慢，一段时间后就不再生长，愈伤组织逐渐老化，既无根状分化物也无芽分化;由叶和叶柄诱导的愈伤组织有少部分(18%)出现不定芽的分化(图2A).将这部分愈伤组织转接至含低浓度细胞生长素(NAA)的培养基C中，培养15～20 d左右发现，不定芽继续生长成叶片，同时伴随大量不定根的发生与生长.但多数叶片叶形不完整(非正常八角莲叶形，图2B)，只有少部分叶片叶形完整(图2C).有36%左右的愈伤组织只有根分化而无芽分化(图2D).添加 AC(0.3%)，既可以有效吸附培养基中的有害物质，防止褐化的发生，又能明显促进根的伸长生长和芽的生长.

培养60 d左右发现，由叶诱导的愈伤组织分化的组培苗多数叶形不完整且无侧芽发生(图2E);由叶柄诱导的愈伤组织分化的组培苗多数叶形完整且有侧芽及丛生芽的发生(图2F)，及时切取这些侧芽或是丛生芽转接至培养基C中，是快速获得大量组培苗的有效方法.

3.3 炼苗移栽 在培养基C中培养60 d左右的组培苗生根效果显著，根系较为发达，但叶片生长相对缓慢，叶片表皮薄，气孔开闭机能弱，植物体内水分调节能力差.所以在炼苗初期，需要将组培苗放置于自然环境下封口炼苗，使其能尽快适应环境.移栽过程中，栽培基质是影响组培苗存活率的重要因素.实验证明，持水性强的泥炭土，配以透气透水性好的珍珠岩作为育苗基质，能保证组培苗的良好生长.将组培苗接到基质上后，要尽可能保持较高的湿度环境，在苗上覆盖塑料薄膜和定时喷雾，组培苗的移栽存活率可达90%.

3.4 愈伤组织、组培品和野生品中鬼臼毒素的含量测定

3.4.1 色谱条件的确定 由图3可知，在设定的HPLC条件下，鬼臼毒素的保留时间约为12.94 min，与其他杂质可实现基线分离.

3.4.2 线性关系的考察 计算得鬼臼毒素回归方程为:Y=aX+b，a=1.626 263 e-003，b=0.901 968 3，R2=0.999 9.结果表明，鬼臼毒素质量浓度在0.01～1.00 mg/mL范围内与峰面积呈现良好的线性关系.

3.4.3 3种愈伤组织中鬼臼毒素的含量测定 取培养60 d的3种愈伤组织，按2.2.2方法制备供试品，在设定的色谱条件下进行测定.HPLC显示(图4)，由叶和叶柄诱导的愈伤组织中鬼臼毒素的含量高于根诱导的愈伤组织，差异显著.

3.4.4 3种愈伤组织不同生长阶段鬼臼毒素的含量测定 分别选取不同生长阶段的3种愈伤组织(培养 30、60、90 d)，每一阶段分别取样 3 次，按2.2.2方法制备供试品，在设定的色谱条件下进行测定，结果见图5.从图5可看出，3种愈伤组织中鬼臼毒素的含量都是随着培养天数的增加而增加，且在同一生长阶段叶柄诱导的愈伤组织中鬼臼毒素的含量都是最高的，分别为(1.22±0.21)、(1.98±0.32)、(2.32 ±0.12)mg·g-1DW;叶诱导的愈伤组织含量次之，分别为(1.01±0.24)、(1.68±0.31)、(2.12±0.28)mg·g-1DW;根诱导的愈伤组织含量最少，分别为(0.74±0.31)、(1.57±0.15)、(1.78 ±0.22)mg·g-1DW.在培养的前60 d，3种愈伤组织中鬼臼毒素的含量都有明显的增长.从工业化生产的角度来看，可以选择在培养基中培养2个月的叶柄愈伤组织进行鬼臼毒素的生产，这样既可以省去分化成苗的环节，又能降低提取原药材的费用.

3.4.5 组培品和野生品中不同部位鬼臼毒素的含量测定 选取培养60 d左右的八角莲组培苗的不同部位(叶、叶柄、根状茎、根)，取样3次;选取一年生的野生八角莲的不同部位(叶、叶柄、根状茎、根)，取样3次.按2.2.2方法制备供试品，在设定的色谱条件下进行测定，结果见图6.从图6可知，八角莲的组培品与野生品所含化学成分类型基本相同，各个部位均含有鬼臼毒素，2者均以叶含量最高.组培品和野生品的叶和叶柄相比，鬼臼毒素含量无明显差异，而2者的根状茎和根相比，鬼臼毒素含量差异显著(表2).从工业化的角度来看，八角莲的叶片和叶柄都是可再生的资源，可以适时采摘八角莲的叶片和叶柄作为提取鬼臼毒素的原材料.

表2 不同供试品中鬼臼毒素的含量比较Table 2 The podophyllotoxin contents of different specimens

俞培忠等［19］建立高效液相色谱法测定4种八角莲中鬼臼毒素含量的方法，考察不同溶剂及提取方法对含量测定结果的影响，认为样品用质量分数80%的甲醇水溶液超声波振荡提取效果最好.潘琦等［15］比较研究了峨眉山野生八角莲根、组培愈伤组织及其诱导根的鬼臼毒素含量，高效液相色谱技术(HPLC)显示组织培养的八角莲愈伤组织和诱导根中均含有鬼臼毒素，分别为0.117%和0.148%，野生品的根中其含量为0.600%，和本试验的测得值相近.陈黎等［20］建立高效液相色谱法测定八角莲中鬼臼毒素的含量，通过比较八角莲根与根茎的HPLC图，认为八角莲根中基本不含鬼臼毒素.与本试验中的测得值不符，可能是材料的选取、提取方法或是色谱条件的不同等原因造成的.

4 讨论

本试验分别以八角莲叶、叶柄和根为外植体，对组织培养及其植株再生进行了研究，同时采用HPLC技术测定了八角莲3种愈伤组织、组培苗和野生植株不同部位(叶、叶柄、根状茎、根)中鬼臼毒素的含量，较全面地比较了八角莲各组织中鬼臼毒素的分布情况.结果显示，愈伤组织诱导能力:根＞叶柄＞叶;愈伤组织易诱导出根，而不易诱导出芽;在对八角莲愈伤组织进行增殖和植株再生培养时，都需要添加一定量的AC，既可以有效地防止褐化，又有利于八角莲根、芽的生长;以珍珠岩∶泥炭土(2∶1)作为育苗基质，苗上覆盖塑料薄膜和定时喷雾，组培苗的移栽存活率可达90%.本试验通过诱导愈伤组织的方法获得了一定量的愈伤组织，但是愈伤组织生长缓慢，继代培养不稳定，分化能力弱，难以建立高效的愈伤组织分化成无菌苗的快繁体系.

八角莲主要以地下根茎入药，但其根茎呈结节状，每年长一节，数年才能入药用.育苗移植的八角莲要八年以上才能收获，利用根茎芽移栽的4 a以后才可起挖，生产周期太长［21］.在利益的驱动下，药贩乱采滥挖，每年的消耗量远远超出了年生产量，可以预期，野生资源的不可持续性利用将进一步制约中药材经济的可持续发展.

笔者认为，为了合理的开发与利用八角莲野生资源，首先必须重视八角莲野生资源的保护，制定八角莲就地和迁地保护的有效策略.其次应该大力开展八角莲野生变家种的栽培技术的研究，扩大药材来源的途径.再次，通过组织培养的方式进行无性快速繁殖，培育大量的幼苗，缩短八角莲成长的年限.

从工业化的角度来看，可以选择在培养基中培养2个月的叶柄愈伤组织进行鬼臼毒素的生产，这样既可以省去分化成苗的环节，又能降低提取原药材的费用.八角莲的组织培养品与野生品所含化学成分类型基本相同，并且八角莲的叶片和叶柄都是可再生的资源，适时的采摘八角莲的叶片和叶柄作为提取鬼臼毒素的原材料，可在不破坏自然资源的前提下快速生产鬼臼毒素，从而为开发鬼臼毒素类抗癌药物提供大量原料.

致谢 四川省大学生创新计划项目(201410636014)对本文给予了资助，谨致谢意.

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