反应温度对鸡骨蛋白酶解液美拉德产物光谱特性和抗氧化活性的影响

许丹，龚燕丹，沈燕飞，聂小华

(浙江工业大学海洋学院，食品科学与工程系，浙江 杭州，310014)

美拉德产物(MRPs)的抗氧化活性是国内外食品领域研究热点之一。MRPs中含有类黑精、还原酮以及一系列含N、S杂环化合物，具有抗氧化性能，其中某些物质的抗氧化强度可与食品中常用的抗氧化剂相媲美［1］。Yilmaza等［2］发现组氨酸 -葡萄糖体系在100℃ 下加热30 min，所得MRPs不具有抗氧化活性，而在120℃下反应不同时间，MRPs的过氧化自由基值显著增加;鲁伟等［3］亦发现精氨酸-葡萄糖反应体系的抗氧化能力随着温度的升高而逐渐增大。温度会影响美拉德反应路径从而影响其产物的生成［4］。

对MRPs抗氧化活性的研究已获得一些成果，但是多集中于还原糖-氨基酸模型系统，而采用蛋白酶解物来提供氨基与还原糖反应的研究鲜见报道。本文采用鸡骨蛋白酶解液与半乳糖在不同反应温度下进行美拉德化修饰，研究其MRPs光谱特性和抗氧化活性，并将其产物清除DPPH自由基能力、羟基自由基清除能力和还原能力与反应进程进行关联分析。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

鸡骨架，市购，去除脂肪、鸡肉部分;D-半乳糖，上海伯奥生物科技有限公司;邻菲罗啉，天津市福晨学试剂厂;DPPH，Sigma-Aldrich上海有限公司;其余试剂均为分析纯，购自于国药集团化学试剂有限公司。

高速冷冻离心机，日本日立公司;紫外可见分光光度计，日本岛津公司;SpectraMax M2多功能酶标仪，美国MD公司;CU-600电热恒温水浴锅，上海福玛实验设备有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 鸡骨蛋白酶解液的制备

称取一定量的鸡骨架，加入1∶1.5(g∶mL)水后于130℃高压蒸煮20 min，匀浆后冷却至50℃加入复合酶(木瓜蛋白酶∶胰酶∶中性蛋白酶=1∶2∶1)200 g，酶解3.5 h后沸水浴灭酶，离心去沉淀，上清液即为水解度34%的鸡骨蛋白酶解液。

1.2.2 鸡骨蛋白酶解液MRPs的制备

将半乳糖添加到鸡骨蛋白酶解液中，使之浓度达到2.4%，然后分装于玻璃试管密封，于40、60、80、90、100℃下反应90 min，反应产物快速冷却、离心，所得滤液即为鸡骨蛋白酶解液MRPs。

1.2.3 褐变程度和中间产物的测定

将MRPs适度稀释，分别于420 nm和294 nm下测定其吸光值。

1.2.4 内源性荧光测定

以347 nm为激发波长，发射波长为300～500 nm下测定MRPs的荧光强度。

1.2.5 DPPH自由基清除率测定

采用Morales等人［5］的方法并稍作修改。将1.5 mL 0.15 mmol/L DPPH溶液置于试管中，加入1.5 mL样品液混匀，室温下暗处放置30 min后，517 nm处测定其吸光值(Ai)。各组样品对DPPH自由基的清除能力用抑制率R表示。

式中，Ac:1.5 mL DPPH加入1.5 mL去离子水;Aj:1.5 mL乙醇加入1.5 mL样品液。

1.2.6 羟基自由基清除率测定［6］

取0.6 mL 5 mmol/L邻二氮菲溶液，依次加入0.4 mL 0.2 mol/L磷酸缓冲溶液(pH 7.4)，混合后加入0.6 mL 5 mmol/L FeSO4溶液，充分混匀，加入样品2 mL以及0.4 mL 0.1%H2O2，于37℃水浴反应60 min，536 nm处测定吸光度A。

式中，A损:以去离子水代替样品;A未损:以去离子水代替样品和H2O2。

1.2.7 还原能力测定

采用铁氰化钾法［7］。取2 mL待测样品，加入2 mL 0.2 mol/L磷酸缓冲溶液(pH 6.6)和2 mL 1%铁氰化钾溶液混匀，50℃水浴加热20 min，迅速冷却后加入1 mL 10%三氯乙酸溶液，振荡摇匀后离心(3 000 r/min，10 min)。取2 mL上清液加入2 mL去离子水，0.4 mL 0.1%FeCl3溶液，振荡混匀后静置10 min，700 nm处测定混合液吸光值。

1.2.8 数据处理与分析

每个试验重复3次，测定结果表示为平均值±标准差。采用Origin 8.5及方差分析方法对实验数据进行分析处理。

2 结果与分析

2.1 反应温度对鸡骨蛋白酶解液MRPs褐变程度和中间产物生成量的影响

褐变程度是判断美拉德反应进入最终阶段的一个重要指标，常采用A420nm来检测美拉德反应进行的程度。反应温度对鸡骨蛋白酶解液MRPs褐变程度影响如图1所示。

图1 反应温度对鸡骨蛋白酶解液MRPs褐变程度和中间产物生成的影响Fig.1 Effect of temperature on browning and intermediate products of MRPs

随着反应温度的升高，鸡骨蛋白酶解液MRPs褐变程度增大，颜色加深，40℃下其A420nm仅为0.26，100℃时则达到0.50，这是因为自由氨基基团在较高温度下更容易与还原糖发生美拉德反应，促进褐变反应进程［1］。

此外美拉德反应过程中会形成大量的中间产物，从而进一步聚合形成类黑精等高分子褐色物质，该中间产物在294 nm下有着明显的紫外特征吸收峰。由图1可知，鸡骨蛋白酶解液MRPs的A294nm随反应温度的增加而增大，说明高温下还原糖更容易发生脱水分解或裂解生成大量的中间产物［1］。

2.2 反应温度对鸡骨蛋白酶解液MRPs内源性荧光光谱的影响

美拉德反应中形成的中间产物一般具有荧光特性，Baisier等［8］认为荧光的积累是由于还原性化合物与胺类之间相互作用发生了不可逆反应而产生的。由图2可知，鸡骨蛋白酶解液MRPs在350 nm处有一个明显的荧光吸收峰，且随着反应温度增加显著下降，推测其可能是蛋白质中Phe、Trp或Tyr残基所形成的;450 nm处亦有荧光吸收峰，符合美拉德产物的荧光特征，其荧光强度随着反应温度的升高(40～80℃)而增加，而后随着反应温度(90～100℃)的继续升高而降低。较高的反应温度有利于美拉德反应过程中荧光中间产物的形成和积累，但高温下美拉德反应越容易进入终极阶段，荧光中间产物相互间或与肽等聚合成高分子褐色物质，导致其积累速率降低，这也符合Benjakul等［7］发现的荧光动力学模式，即荧光强度先达到最大值而后降低。刘平等人在研究二甘肽-木糖美拉德反应体系时亦发现了347 nm和430 nm两处荧光吸收峰［9］。

图2 反应温度对鸡骨蛋白酶解液MRPs荧光光谱的影响Fig.2 Effect of temperature on flurorescence intensity of MRPs

2.3 反应温度对鸡骨蛋白酶解液MRPs清除DPPH自由基能力的影响

反应温度对鸡骨蛋白酶解液MRPs清除DPPH自由基能力的影响如图3所示。当反应温度为40～60℃时，鸡骨蛋白酶解液MRPs清除DPPH自由基能力较低，仅为46.49%(40℃);而反应温度高于80℃后，其产物清除DPPH自由基能力随着反应温度的升高而显著升高，可达到86.18%(100℃)。章银良等［1］亦发现酪蛋白-木糖模式美拉德产物对DPPH自由基的清除能力随着反应温度的升高而增加;赵晶等［10］则分别研究了80～100℃下酪蛋白-葡萄糖MRPs、酪蛋白-乳糖MRPs的抗氧化活性，结果表明反应温度越高，MRPs对DPPH自由基的清除能力越强。这是因为较高温度下能生成较多的类黑精、还原酮等物质，这些物质都具有清除DPPH自由基的能力［11］。

图3 反应温度对鸡骨蛋白酶解液MRPs清除DPPH自由基能力的影响Fig.3 Effect of temperature on DPPH radical scavenging activity of MRPs

2.4 反应温度对鸡骨蛋白酶解液MRPs清除羟基自由基能力的影响

从图4可知，反应温度越高，鸡骨蛋白酶解液MRPs清除羟基自由基的能力则越大，从0.48%(40℃)增加到14.81%(100℃)。该研究结果与章银良等［1］报道相一致。但 Vhangani等［12］在对核糖-赖氨酸和果糖-赖氨酸模拟体系MRPs进行研究时发现，不同反应温度下形成的MRPs在清除羟基自由基方面并不存在显著性差异。与DPPH自由基清除能力相比，鸡骨蛋白酶解液MRPs清除羟基自由基能力较低，这可能是由于MRPs金属螯合能力干预了其羟基自由基清除能力［13］。Vhangani等［12］亦发现赖氨酸-糖模拟体系的DPPH自由基清除能力远大于其对羟基自由基的清除能力。

2.5 反应温度对鸡骨蛋白酶解液MRPs还原能力的影响

图4 反应温度对鸡骨蛋白酶解液MRPs清除羟基自由基能力的影响Fig.4 Effect of temperature on hydroxyl radical scavenging activity of MRPs

由图5可知，鸡骨蛋白酶解液MRPs有较好的还原能力，且还原能力随着反应温度的升高而增强，其中100℃下还原能力是40℃下的3倍。Vhangani等［12］表明121℃下赖氨酸-果糖MRPs的还原能力远大于60℃下的还原能力;赵晶等［11］也发现100℃下酪蛋白-还原糖MRPs所呈现的还原能力最高。MRPs还原能力主要源于还原酮类物质和高温下美拉德反应形成的褐色高分子聚合物类黑精，此类物质具有显著的抗氧化性。

图5 反应温度对鸡骨蛋白酶解液MRPs还原能力的影响Fig.5 Effect of temperature on reducing power of MRPs

2.6 相关性分析

美拉德反应产物光谱特性与其抗氧化活性之间存在着一定的关联［11］，两者之间相关性分析如表1所示。鸡骨蛋白酶解液MRPs清除DPPH自由基能力与褐变程度、A294nm变化有着较好的线性关系，相关系数分别为0.908 4和0.929 6，这与孟艳丽［11］、沈军卫［14］等人的结果相似。此外，鸡骨蛋白酶解液MRPs的还原力与褐变程度、A294nm之间呈现正相关性，褐变程度越高和中间产物生成量越多，还原能力越强。Benjakul等［7］亦研究表明，猪血浆蛋白-糖 MRPs的还原力与褐变程度、A294nm之间显著相关。但鸡骨蛋白酶解液MRPs羟基自由基清除率与褐变程度、A294nm线性关系较差。

表1 MRPs的光谱特性和抗氧化活性间的相关分析Table 1 Correlation analysis betweenspectral characterisitics and antioxidant of MRPs

3 结论

对不同反应温度下鸡骨蛋白酶解液-半乳糖MRPs进行光谱特性和抗氧化能力分析，结果表明，MRPs褐变程度、中间产物生成量和荧光强度均随着反应温度的升高而升高;MRPs的自由基清除能力和还原能力亦随之反应温度的升高而增加，其DPPH自由基清除能力远大于羟基自由基清除能力，说明鸡骨蛋白酶解液-半乳糖MRPs具有良好的抗氧化活性。此外，MRPs的DPPH自由基清除能力和还原能力与其褐变程度、中间产物生成量有着良好的正相关性。

［1］ 章银良，张陆燕，周文权，等.不同温度对酪蛋白-木糖模式美拉德反应产物抗氧化性的影响［J］.现代食品科技，2014(4):211-219.

［2］ Yilmaz Y，Toledo R.Antioxidant activity of water-soluble Maillard reaction products［J］.Food Chemistry，2005，93(2):273-278.

［3］ 鲁伟，黄筱茜，柯李晶，等.美拉德反应产物的抗氧化活性研究［J］.食品与机械，2008，24(4):61-64.

［4］ Martins S I F S，Van Boekel M A J S.A kinetic model for the glucose/glycine Maillard reaction pathways［J］.Food Chemistry，2005，90(1-2):257-269.

［5］ Morales F J，Jimenez-Perez，S.Free radical scavenging capacity of Maillard reaction products as related to colour and fluorescence［J］.Food Chemistry，2001，72:119-125.

［6］ Lee J C K H R，Kim J，et al.Antioxidant property of an ethanol extract of the stem of Opuntia ficus-indica var.Saboten［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2002，50(22):6 490-6 496.

［7］ Benjakul S，Lertittikul W，Bauer F.Antioxidant activity of Maillard reaction products from a porcine plasma proteinsugar model system ［J］.Food Chemistry，2005，93(2):189-196.

［8］ Baisier W M，Labuza T P.Maillard browning kinetics in a liquid model system［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，1992，40(5):707-713.

［9］ 刘平，邢亚阁，张晓鸣，等.二甘肽-木糖美拉德反应交联特性研究［J］.食品工业科技，2014，35(11):64-68.

［10］ 赵晶，马丹雅，张筠，等.酪蛋白与还原糖美拉德反应产物抗氧化性的研究［J］.食品工业科技，2011，32(12):187-189;293.

［11］ 孟艳丽，曾名湧，张军宁，等.温度对鲢鱼肽美拉德反应产物的化学特性和抗氧化活性的影响［J］.海洋湖沼通报，2013(1):69-74.

［12］ Lusani Norah Vhangani J V W.Antioxidant activity of Maillard reaction products(MRPs)derived from fructoselysine and ribose-lysine model systems［J］.Food Chemistry，2013，137:92-98.

［13］ 刘蒙蒙，杨美智子，孙云，等.罗非鱼鱼皮胶原肽-葡萄糖美拉德反应产物的制备及其抗氧化活性［J］.食品与发酵工业，2014，40(3):158-162.

［14］ 沈军卫，樊金玲，朱文学，等.模式美拉德反应产物的抗氧化性与反应进程的关系研究［J］.食品科技，2010，31(3):253-257.