同种属来源一抗在免疫荧光双标记染色中的可行性

陈 曦 刘 哲 邓茂林 冯 轼

（成都大学 附属医院消化内科，成都610041）

近年来，免疫荧光染色技术在生物及基础医学的科学研究中运用越来越广泛，当需要在同一组织／细胞上检查两种不同抗原时，则需要进行免疫荧光双标记染色［1］。顺序法免疫荧光双标记染色因为操作流程复杂、操作时间长等缺点而濒于淘汰，但实际的科研工作中受实验经费、条件等限制，常常遇到一抗种属来源相同无法进行同步法免疫荧光双标记染色的情况。本研究通过对小鼠结肠组织白细胞介素-17（Interleukin-17，IL-17）［2］和肠神经胶质细胞源性神经营养因子（Glial cell line-derived neurotro-phic factor，GDNF）特异性受体亚基 GFR-α1（GDNF family receptor-α1，GFR-α1）［3］进行的种属来源一抗顺序法免疫荧光双标记染色，探讨了特异性分泌IL-17的肠Th17细胞中GDNF受体的表达，并对如何避免同种属来源一抗的交叉染色等问题进行了分析讨论。

1 材料与方法

1．1 主要试剂

Balb／c小鼠购自四川大学实验动物中心，葡聚糖硫酸钠（Dextran sulfate sodium，DSS）购自Pharmacia Corporation公司。兔抗鼠抗IL-17抗体和兔抗鼠抗GFR-α1抗体购自北京博奥森生物技术有限公司，四甲基异硫氰酸罗丹明（Tetramethylrhodam-ine，TRITC）标记山羊抗兔二抗和异硫氰脂荧光素（Fluorescein isothiocyanate，FITC）标记山羊抗兔二抗购自北京中山金桥生物技术有限公司。

1．2 构建动物模型

参考Cooper等［4］的文献报道构建小鼠DSS结肠炎模型。将4-6周龄、体重约20g的Balb／c雌性小鼠以5%（w／v）的DSS溶液让小鼠自由饮用，每天光照／黑暗各12小时，1周后处死小鼠取结肠组织迅速冰冻切片。

1．3 顺序法免疫荧光双染

组织冰冻切片95%酒精室温固定10分钟，PBS洗3次，每次5分钟，1%Triton X-100室温处理10分钟，PBS洗3次，10%山羊血清37℃封闭1小时，去除山羊血清（不用PBS清洗），抗GFR-α1抗体（1∶500稀释）4℃孵育过夜，室温复温30分钟，PBS洗3次（以下步骤避光），FITC标记山羊抗兔二抗37℃孵育1．5小时，PBS洗3次。10%山羊血清37℃再次封闭1小时。抗IL-17抗体（1∶200稀释）37℃孵育1小时，PBS洗3次，TRITC标记山羊抗兔二抗37℃孵育1小时，PBS洗3次。抗粹灭封片液封片后于荧光显微镜下观察拍照。分别设置一抗A阴性（孵育一抗A时以PBS代替）和一抗B阴性（孵育一抗B时以PBS代替）的单阴对照组。

2 结果

如图1所示，在小鼠结肠黏膜层、黏膜下层、肌层均可见广泛的GFR-α1表达，呈FITC标记的绿色，而在黏膜及黏膜下层亦可见IL-17表达，呈TRITC标记的红色。尽管冰冻切片组织结构欠清晰，但在两种不同荧光的对比之下，可以看到黏膜及黏膜下层可见被绿色荧光和红色荧光双重标记的阳性细胞，提示IL-17＋的Th17细胞表面有GDNF特异性受体亚基GFR-α1表达。一抗A阴性的对照组，除了残留的少量杂质以外，目标组织几乎不显示绿色荧光，一抗B抗阴性的对照组，仍可见红色荧光显色，但其强度较弱，可基本被绿色荧光覆盖。

3 讨论

荧光免疫双染分为直接法和间接法。直接法是指采用不同颜色荧光素直接标记的两种抗体同时孵育目标组织并显色的方法，这种方法优点是特异性高，可以有效的避免两种抗体的交叉反应，缺点是敏感性相对较低、且直接标记荧光素的一抗价格昂贵。间接法又分为同步法和顺序法，同步法是指两种不同种属来源的一抗混合同时孵育目标组织，然后再采用不同颜色荧光素标记的二抗混合同时孵育目标组织，这种方法的优点是特异性和敏感性兼顾，实验操作简单，性价比较高，因而是目前免疫荧光双标染色最常使用的方法［5］。但当两种抗原存在同一部位时，同步法的其中一种一抗可能会妨碍另一种一抗与抗原的结合，导致另一种抗原检测的敏感性降低，此时，采用顺序法，先染色含量较少的抗原，再染色含量较多的抗原，尽管实验操作流程更为复杂，但可明显提高含量较少的抗原显色的敏感性［6］。传统观念认为，抗原的识别主要依赖一抗，二抗结合一抗的Fc段，是非特异性的识别，因此，即使是顺序法，也应该采用两种不同种属来源的一抗，以此避免两种二抗的交叉反应。但实际工作中常常受实验条件所限，当有且仅有同一种属来源的两种一抗时，是不是就一定无法作出可信的免疫荧光双染结果呢？

图1 肠Th17细胞中GDNF受体的表达

首先，我们要清楚顺序法间接荧光免疫双染采用同种属来源一抗产生交叉反应的原因。第一，当二抗A不足够结合一抗A时，余留的一抗的Fc段便可能与后来加入的二B结合产生交叉反应，针对第一种情况，如果我们使用的二抗A足量甚至略超过一抗A的结合力、孵育时间又足够长时，理论上是可以让一抗A的Fc段完全被二抗A结合的［7］，但这样就可能带来第二种交叉反应产生的可能，即过量的二抗A清洗不干净时，后加入的一抗B可能会与二抗A反应，产生假阳性结果，针对第二种情况，彻底的清洗理论上也可以避免。还有人提出第三种交叉反应的可能，因为每个抗体的结合位点不止一个，如果二抗A超量，那么很可能其与一抗A结合后仍有空着的位点仍有可能与一抗B结合，再加入二抗B时，又与二抗B结合，这样就出现了重标，针对第三种情况，又有人提出，既然二抗是非特异性的，那么一抗B之前再次使用二抗同源血清封闭，有可能封闭二抗B未结合的位点，避免交叉反应。因此，当一抗为同种属来源时，适当增加二抗A的浓度并予足够的孵育时间、彻底清洗，延长血清封闭时间并适当减少一抗B的浓度，理论上是有可能避免抗体之间交叉反应的。本研究将二抗A的浓度提高为说明书推荐浓度的2倍，延长孵育时间至1．5小时，在一抗A和一抗B使用之前均进行二抗同源血清封闭，封闭时间延长至1小时，为减少二抗A的荧光粹灭，一抗B于37℃孵育1小时。结果可见结肠黏膜及黏膜下层被绿色荧光和红色荧光双重标记的阳性细胞，并没有出现因为交叉反应导致两种荧光表达位置重叠而无法达到实验目的的情况。

为了进一步探讨顺序法染色所致的交叉反应对结果判断的影响，我们分别设置了一抗A阴性和一抗B阴性的对照组。结果显示，一抗A阴性的对照组，除了残留的少量杂质以外，目标组织几乎不显示绿色荧光，证实我们的清洗方法可彻底清洗非特异性吸附的荧光二抗，有效避免了残留荧光二抗A与一抗B交叉反应的可能。而一抗B抗阴性的对照组，仍可见强度较弱的红色荧光显色，在实验操作中，我们已经加入了足够结合一抗A的二抗A并予以了足够长的孵育时间，故残留未结合的一抗A Fc段与二抗B结合的可能性较小，而由于一抗B之前再次使用二抗同源血清封闭二抗B未结合的位点的方法缺乏可靠的文献依据，因此，我们推测一抗B抗阴性的对照组仍可见部分红色荧光显色的原因可能为血清封闭其实并不能很好的封闭掉有多个结合位点的二抗A中未予一抗A结合的点，因此仍可能导致部分交叉反应，而这种交叉反应引起的非特异性染色，应该是与一抗A位置几乎重叠的，这也是许多研究员采用顺序法染色得出两种荧光表达位置完全相同的原因。尽管如此，对照组的红色荧光强度明显弱于实验组，真正的红色荧光阳性着色部分荧光强度与绿色荧光强度相同甚至更高，使双标阳性的细胞显示出明亮的橙色或黄色，已有研究发现，尤其当两种目标抗原表达位置不同时，两种荧光重叠后并不会因为交叉反应所致的非特异性染色而无法判断阳性结果［8］。正如我们的实验结果所示，绿色荧光的范围明线比红色荧光的范围广，提示除IL-17＋细胞外，DSS小鼠结肠炎模型的结肠组织中还有许多其他细胞也表达GFR-α1，这一结果亦与既往文献报答相符［9，10］。

综上所述，采用顺序法进行免疫荧光双标记染色，尤其是当已知两种目标抗原表达位置不同时，通过调整抗体浓度、加强封闭及彻底清洗等办法，同一种属来源的一抗仍可得出可信的实验结果。

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