新生小鼠肺组织取材方法的改进

张国强 翟 艳 孙阿林 张立明

1（潍坊医学院 儿科学教研室，潍坊261053）

2（潍坊市人民医院 健康查体中心，潍坊261041）

3（潍坊医学院 内科学教研室，潍坊261053）

4（潍坊市人民医院 新生儿科，潍坊261041）

在呼吸系统相关疾病研究中，将肺组织进行石蜡包埋后切片是最基本的方法。文献报道肺组织取材方法各异，总结如下：直接取材；在体／离体气管灌注后取材［1，2］。笔者实验发现，前述方法对大鼠或者成年小鼠效果较好，但对于新生鼠特别是新生小鼠，因其重量小、气管管径小、呼吸系统发育不完善，不易准确进行气管灌注。勉强进行灌注后，也极易造成肺泡结构损伤。对于新生小鼠，实验发现采用肺循环联合体循环灌注后对组织进行修块的方法，可以制作出较为理想的新生小鼠肺组织切片，为新生小鼠实验提供可靠取材方法。

1 材料

新生5天的昆明小鼠16只，每组4只，体重（3．17±0．16）g；1．2一次性使用静脉输液器（规格：0．45×13．5RWLB）；1．3生理盐水（NS）、4%多聚甲醛（PFA）、石蜡包埋机、梯度酒精、二甲苯、石蜡切片机、烤箱、HE染色剂、显微镜等。

2 方法

新生小鼠乙醚麻醉后，打开腹腔、胸腔并充分暴露心肺，注意勿伤及心肺组织。

方法A：未行灌注，剪断腹主动脉、下腔静脉放血处理后取材；

方法B：腹腔放血后行气管灌注：将静脉输液器针头直接插入气管并固定后缓慢灌注PFA至肺组织充盈后取材；

方法C：未行腹腔放血，行肺循环、体循环灌注后取材：先剪开左心耳，于右心室位置插入静脉注射器针头3mm左右，借助心脏搏动用NS行肺循环灌注，至肺组织变白、左心耳出无血液流出；剪开右心耳并将针头插入左心室行体循环灌注至肝脏变为土黄色、右心耳无血液流出；采取同样办法，PFA分别行肺／体循环灌注2～3min后取材。注意灌注速度不宜过快，保持40滴／每分，避免肺组织水肿。

取肺方式：左肺于肺门处结扎、剪下，于NS中漂去表面血迹，将肺组织修剪为2×4×6mm左右大小，然后浸入PFA中固定24～48小时，后续水洗、脱水、透明、浸蜡、切片、HE染色按常规操作。

3 结果

方法A：肺组织结构紊乱，红细胞广泛分布（见图1A）；方法B：肺组织结构发生明显变形，红细胞残留（见图1B）；方法C：肺组织结构良好，无红细胞残留（见图1C）。

4 讨论

新生小鼠肺结构发育不成熟。文献报道，生后5天的小鼠肺组织处于囊泡期［］。腹腔放血后直接取材，肺组织结构不完整，红细胞广泛分布；若腹腔放血后后行气管灌注，在灌洗液的作用下，肺组织结构将发生明显变形；因肺组织为双重供血（肺循环供血与起源于体循环的支气管动脉供血），因此分别行肺循环、体循环灌注，可以最大限度保持肺组织形态，减少肺内血液残留，经HE染色证实，此方法获得的肺组织结构良好，无红细胞残留。

图1 不同方法获取的新生小鼠肺组织HE染色结果

取材后修块的目的在于使肺组织厚度减小，利于固定液渗入；形态规整的组织块亦可以避免二甲苯透明时因肺组织形态不规则而发生卷曲变形，影响后续切片。

5 结论

采取肺／体循环双重灌注后修块的的方式可以最大限度保持新生小鼠肺组织形态，是新生小鼠肺组织切片的理想方法。

［1］ 李冰，刘同慎．肺组织切片的取材和固定新方法［J］．生物学通报，2013，01：61-62．

［2］ 尚宏伟，李宝红，王兴翠，等．大鼠肺组织制片方法的改进［J］．首都医科大学学报，1999，02：55-56．

［3］ Ten Have-Opbroek AA．The development of the lung in mammals：an analysis of concepts and findings［J］．Am J Anat，1981，162（3）：201-19．