钙离子通道β2亚基基因rs4373814位点多态性与东北汉族人群原发性高血压易感性的关联研究

张海英，宋娟娟，李天晓，王懿，吕信鹏，周宏博，邓颖

钙离子通道β2亚基基因rs4373814位点多态性与东北汉族人群原发性高血压易感性的关联研究

张海英，宋娟娟，李天晓，王懿，吕信鹏，周宏博，邓颖

目的：探索钙离子通道β2亚基（CACNB2）基因rs4373814位点的多态性与东北汉族人群（黑龙江省及周边地区）原发性高血压易感性的关联性。

方法：采用病例—对照研究方法，在哈尔滨医科大学附属第二医院就诊的患者中收集原发性高血压患者1 006例作为病例组，体检人群中随机选取同期血压正常者992例作为对照组，总计研究人群1 998例。应用Snapshot技术检测CACNB2基因rs4373814位点单核苷酸多态性，利用SPSS 19.0统计学软件进行数据分析处理。

结果：CACNB2基因rs4373814位点危险等位基因C的频率分布在病例组和对照组间具有显著性差异[P=0.039，比值比（OR）=1.068，95%可信区间（CI）：1.004～1.137]。经Logistic回归校正性别、年龄、BMI、吸烟、饮酒后，发现显性模型CC+GC/GG：增加高血压患病风险（P=0.037，OR=1.260，95%CI：1.013～1.567）。

结论 ：CACNB2基因rs4373814位点单核苷酸多态性与东北汉族人群原发性高血压的易感性存在显著关联。

原发性高血压；CACNB2基因；单核苷酸多态性；关联研究

Methods: A case-control study in Han population at northeastern of China was carried out and the research included 1998 participants as 2 groups: EH group, n=1006 patients treated in our hospital, and Control group, n=992 subjects with normal blood pressure from physical examination. The rs4373814 polymorphisms were examined by Snapshot technique and the statistical analysis was performed by SPSS 19.0 software.

Results: The rs4373814 risk allele C frequency of CACNB2 gene was significantly different between EH group and Control group, P=0.039, OR=1.068, 95% CI （1.004-1.137）. Logistic regression analysis showed that with adjusted gender, age, BMI, smoking, drinking, in dominant model, the genotype rs4373814 carring CC + GC/GG obviously increased the risk of EH occurrence, P=0.037, OR=1.260, 95% CI （1.013-1.567）.

Conclusion: The rs4373814 polymorphisms of CACNB2 gene are related to the susceptibility of EH occurrence in Han population at northeastern area of China.

1 998例受试者抽取空腹静脉血300 μl，乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝，应用北京全式金公司生产的血液基因组DNA抽提试剂盒提取人血全基因组DNA（严格按试剂盒说明书进行操作）。经1.5%琼脂糖凝胶电泳确认提取的人全基因组DNA产物片段完整和含量较高后，将DNA产物保存于-20℃冰箱。

1.3 单核苷酸多态性（SNP）检测及基因型分析

影响血压的环境因素主要包括：高钠、低钾膳食、肥胖、吸烟、饮酒、精神紧张等[1，2]。研究表明，原发性高血压具有明显的遗传倾向，其遗传度为30%～70%[3]。目前，随着分子生物学的迅速发展以及人类基因组计划的完成，从基因层面着手寻找原发性高血压的发病原因已成为研究热点。大量研究表明，钙离子通道在原发性高血压的发病机制中起着重要作用，其β2亚基通过与α1C亚基结合来调节钙离子通道的电流强度、电压依赖性、激活与失活特性，从而对血压产生影响。近年来国际上的全基因组关联分析（genome-wide association study, GWAS）已经发现了数十个高血压的遗传位点，其中钙离子通道β2亚基（calcium channel β2 gene， CACNB2）基因的多态性在欧美、亚洲等地人群中已证实与原发性高血压显著关联[4-7]。我国学者曾在南方地区汉族人群中进行了CACNB2基因多态性与原发性高血压关联的验证性试验，结果显示，CACNB2基因多态性与汉族人群原发性高血压的发生显著关联[8-11]。研究报道，中国汉族人群的基因频率分布在南北地区存在差异，关于CACNB2基因rs4373814位点的多态性与原发性高血压发生的关联性研究在东北汉族人群中至今少见报道。本试验拟研究CACNB2基因rs4373814位点与东北汉族人群原发性高血压发生的关联性。

1 对象与方法

1.1 研究对象

选取2012-05至2013-05我院住院患者和门诊体检患者共计1 998例，其中原发性高血压患者（病例组）1 006例，血压正常者（对照组）992例。所有研究对象均为长期居住在黑龙江省及周边地区的汉族人群，且无血缘关系。

入选标准：病例组：参照2005年世界卫生组织及高血压协会诊断标准，收缩压≥140 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa）和（或）舒张压≥90 mmHg，或血压＜140/90 mmHg，且已确诊为原发性高血压，应用降压药物治疗者，并排除继发性高血压、心肌病、先天性心脏病、风湿性心脏瓣膜病等。对照组：同期随机选取门诊体检血压正常者，收缩压 ＜140 mmHg，舒张压＜90 mmHg，且无高血压家族史。所有入选对象均为40岁以上的成年人，无Brugada综合征、孤独症、 注意力缺损多动障碍、躁狂症、抑郁症、精神分裂症等精神类疾病。吸烟者定义为：每天吸烟5支及以上者，且连续吸烟时间超过6个月或戒烟小于1年。饮酒者定义为：每天饮酒250 ml及以上者，且连续饮酒时间超过1年或戒酒小于1年者。

所有入选研究对象均签署知情同意书。研究得到哈尔滨医科大学附属第二医院伦理委员会认可，研究内容符合《赫尔辛基宣言》。

1.2 基因组脱氧核糖核酸（DNA）的提取

采用Snapshot 方法检测rs4373814位点的多态性。（1）聚合酶链式反应（PCR）扩增引物序列为F：ATTCCCCTGTAGGGCTATGA，R：AATTCTTTGCCTGCTTTTCTG。PCR反应总体积25 μl，其中包括2.5 μl 10×PCR buffer，0.8 μl MgCl2（50 mmol/L），0.5 μl dNTP（10 mmol/L），各0.5 μl的上、下游引物，1 μl模板DNA，0.2 μl tap酶（5U），19 μl ddH2O。反应条件：95℃预变性5 min，95℃变性30 s，56℃复性30 s，72℃延伸30 s，共33个循环，最后72℃延伸5 min。（2）PCR扩增产物按照虾碱酶方法纯化，总体积为10 μl，其中包括PCR 产物2 μl ，SAP（1 U/μl）0.3 μl，Exo I（20 U/μl）0.2 μl，ddH2O 7.5 μl，震荡混匀，37℃孵育90 min，75℃保温15 min灭活SAP和ExoI酶，4℃保存24 h。（3）使用SNaPshot（ABI）试剂盒进行单碱基延伸反应，微测序引物序列为TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT TTGCATATTGTCCTTCTCCG，反应体积为3 μl，其中包括SNaPshot混合液1.5 μl，PCR产物1 μl和微测序引物0.5 μl。反应条件：96℃变性10 s，51℃复性5 s，60℃延伸30 s，共25个循环，最后4℃保存。（4）进行产物纯化，反应总体积为5 μl，其中包括：延伸产物3 μl ，SAP（1 U/μl）0.3 μl，ddH2O 1.7 μl，震荡混匀，37℃孵育1 h，75℃保温 15 min灭活SAP酶，4℃保存24 h。（5）最后每个反应体系中加入1 μl上述纯化延伸产物，与0.2 μl的GenescantTM-120LIZ Size Stangard和8.8 μl去离子甲酰胺混匀后，95℃变性 5 min，再利用ABI公司的ABI13730测序仪和GeneMapper 4.0软件对SNP位点进行基因分型。基

因分型检出率99.9%。

1.4 统计学方法

应用SPSS 19.0 统计软件进行数据分析处理。计量资料数据采用均数±标准差表示，两组间的差异采用t 检验。计数资料用频数（%）表示，采用χ2检验分析对照组的等位基因频率分布是否符合Hardy-Weinberg平衡定律（HWE）。病例组与对照组间的等位基因频率、性别、吸烟、饮酒的分布差异采用χ2检验，并计算比值比（OR）值及95%可信区间（CI）。采用Logistic回归检验rs4373814位点基因型在病例—对照组中的分布规律。所有统计采用双侧概率检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般临床资料比较（表1）

两组间的年龄、性别、体重指数（BMI）、饮酒、吸烟差异均无统计学意义（P＞0.05）。

2.2 CACNB2基因rs4373814等位基因频率分布的差异

本研究的CACNB2基因位点rs4373814的基因频率符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律（P=0.827），选取样本具有群体代表性。千人基因组计划显示了不同人群间rs4373814最小等位基因频率，非洲：0.602，美国：0.439，欧洲：0.479，东亚：0.535，中国北京：0.545，中国南方：0.577。本研究对照组为0.537，与千人基因组计划的东亚和中国北京最小等位基因符合。CACNB2基因位点rs4373814危险等位基因C在病例组分布频率为0.570，病例组分布频率明显高于对照组（0.537），差异有统计学意义（P=0.039，OR=1.068，95%CI：1.004～1.137）。

2.3 不同遗传模型的rs4373814基因型频率与高血压患者的关联分析（表2）

经Logistic回归校正性别、年龄、BMI、吸烟、饮酒后，发现显性模型CC+GC/GG增加高血压患病风险（P=0.037，OR=1.260，95%CI：1.013～1.567）。加性模型CC/GG、GC/GG和隐性模型CC/GC+GG未增加高血压患病风险（CC/GG：P=0.031，OR=1.316，95%CI：1.025～1.689；GC/GG： P=0.486，OR=1.075，95%CI：0.878～1.316；CC/GC+GG：P=0.168，OR=1.143，95%CI：0.945～1.382）。

表1 一般临床资料比较

表2 不同遗传模型下rs4373814基因型频率与高血压患病的关联分析

3 讨论

高血压是最常见的慢性病，其影响了10%～20%成年人的健康[10]。因此，识别导致高血压的基因变异不仅可以提高对疾病病理生理过程的理解，也能阐明其生化和生理途径中涉及的诸多危险因素[12]。

本试验选取中国东北（黑龙江省及周边地区）汉族人群，进行了CACNB2基因rs4373814位点与原发性高血压的关联性研究。黑龙江省为我国高血压高发区，从1958年～2007年5次流行病学调查显示，该地区高血压的患病率分别为8.26%、9.65%、11.87%、17.06%和25.69%，患病率始终高于全国的平均水平，且呈逐年增高的趋势[13]。究其原因主要有以下几个方面：黑龙江省气候寒冷，冬季持续时间较长，且久居于此的人群大部分有高盐低钾、高脂肪和高热量饮食习惯，且饮酒、吸烟者比例较高，吸烟、饮酒量也较大。相关因素分析认为高血压与高血压家族史、年龄、性别、职业、吸烟、饮酒、BMI等因素存在多元线性关系，其中高血压家族史是其发病的主要相关因素[13]。高血压与基因多态性的关联存在人群异质性，因此本试验对黑龙江省汉族人群进行高血压遗传基因的研究，对于验证GWAS的基因变异在不同地区人群作用具有重要意义。

CACNB2基因位于10p12区域，共有20个外显

子，基因组大小约400 kb，有4个不同的转录起始位点，通过选择性剪切，总共转录10多种转录体。电压依赖性L型钙离子通道（Voltage-dependent L-type calcium channel, L-VDDC）包括α1、α2δ和β亚单位，其中β亚基还有4个亚型（β1、β2、β3、β4）。钙离子通道β2亚单位主要通过与α亚基结合调节L-VDDC的电流强度、电压依赖性、激活与失活特性，从而对动脉血压的变化形成一定的影响[14]。因此，CACNB2基因位点的变异能够影响蛋白水平的表达，从而导致血压的变化[15]。

本研究较早在中国北方汉族人群验证CACNB2基因rs4373814位点多态性与中国北方汉族原发性高血压的关联性，发现CACNB2基因rs4373814位点的高血压危险等位基因为C，并且在病例组分布频率高于对照组，差异有统计学意义（P=0.039，OR=1.068，95%CI：1.004～1.137）。经Logistic回归校正性别、年龄、BMI、吸烟、饮酒后，进行不同遗传模型的CACNB2基因型分布的差异性分析，仅在显性模型下发现该位点风险等位基因基因型CC+GC/GG 显著增加了高血压的患病风险（P=0.037，OR=1.260，95%CI：1.013～1.567），而加性模型和隐性模型下基因型的差异未影响到高血压的发病。 Ehret 等[16]对69 395例欧洲个体进行了Meta分析，结果同样显示CACNB2基因rs4373814位点与高血压的易感性密切相关，危险等位基因为C（P=8.5×10-8）。该结论与我们的研究结果相一致， Hong 等[10]在我国福建省汉族人群中，进行了CACNB2基因rs4373814位点与高血压关联性验证，结果显示，显性模型下C/G+G/G基因型使高血压的风险降低（P=0.022，OR=0.70，95%CI：0.51～0.95）。该结果同样说明rs4373814位点的等位基因C为危险等位基因，与我们的研究结果一致。由此可以得出结论，CACNB2基因rs4373814多态性与中国汉族人群原发性高血压的易感性存在显著相关性，等位基因C可能会增加汉族人群原发性高血压的发病风险。

综上所述，我们的研究证实了CACNB2基因rs4373814的遗传多态性与高血压易感性的显著关联，为原发性高血压的预防或药物靶点的治疗提供了实验基础。同时这也为我们对原发性高血压产生了新的理解，将管理的重点转向预防而不是治疗。高血压是遗传基因与许多致病性增压因素和生理性减压因素相互作用而引起的复杂疾病，单个基因的单个位点对原发性高血压的发病危险的作用极其微弱。同时高血压受到多基因与环境因素等共同作用，多基因之间与基因—环境的交互作用则有待于进一步研究。因此，我们的研究需要进一步在大流行病学样本中被验证和进行功能学研究。

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Association Study Between the rs4373814 Polymorphisms of Calcium Channel Gene and the Susceptibility of Essential Hypertension in Han Population at Northeastern Area of China

ZHANG Hai-ying, SONG Juan-juan, LI Tian-xiao, WANG Yi, LV Xin-peng, ZHOU Hong-bo, DENG Ying.
Department of Emergency, The Second Affiliated Hospital of Harbin Medical University, Harbin （150086）, Heilongjiang, China

Objective: To investigate the relationship between rs4373814 polymorphisms of calcium channel （CACNB2） gene and the susceptibility of essential hypertension （EH） occurrence in Han population at northeastern area of China.

Essential hypertension; Calcium Channel gene; Single nucleotide polymorphism; Association study（Chinese Circulation Journal, 2015,30:661.）

2015-01-04）

（编辑：漆利萍）

黑龙江省自然科学基金（D201204）

150086 黑龙江省哈尔滨市，哈尔滨医科大学附属第二医院 急诊医学科（张海英、宋娟娟、吕信鹏、邓颖）；哈尔滨医科大学生物化学与分子生物学教研室（李天晓、周宏博），生物技术实验教学中心（王懿）

张海英 硕士研究生 主要从事急危重症的抢救，中毒的治疗等研究 Email: zhanghaiyinggys@163.com 通讯作者：邓颖

Email：ldlrrr@163.com

R541

A

1000-3614（2015）07-0661-04

10.3969/j.issn.1000-3614.2015.07.012