长链非编码RNA在胰腺癌中的研究进展△

陈梦婷 代娟娟 江明杰 田聆

上海交通大学附属第一人民医院实验中心，上海201620

长链非编码RNA在胰腺癌中的研究进展△

陈梦婷*代娟娟*江明杰 田聆#

上海交通大学附属第一人民医院实验中心，上海201620

胰腺癌是一种恶性程度高、发展迅速、预后极差的恶性肿瘤，迄今为止除手术外尚无其他有效的治疗措施。因此，深入了解胰腺癌发生发展的分子机制，发现新的潜在治疗靶点尤为重要。长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是一类长度大于200个核苷酸的非编码RNA，在许多恶性肿瘤中发挥重要的调控作用，参与肿瘤细胞的增殖、凋亡、侵袭和远处转移等，在胰腺癌的诊断与治疗中有着广阔的临床应用前景。目前的研究发现，HOTAIR、MALAT1、H19等多种类型的lncRNA在胰腺癌中存在表达异常的现象。

长链非编码RNA；胰腺癌；肿瘤发生发展；肿瘤治疗

胰腺癌是目前已知恶性程度最高的肿瘤之一，五年生存率仅有4.1%，且其发病率与病死率几乎持平。2012年全球约有33.8万人罹患胰腺癌，因胰腺癌死亡的患者达到了33万人[1-2]。在我国，胰腺癌发病率近20年来增加了6倍，2012年胰腺癌发病率为4.8/10万，居所有恶性肿瘤的第7位，患者人数与脑癌、肾癌、白血病的发病人数相近，高达65 778人；2012年胰腺癌死亡率为4.7/10万，死亡人数达63 662人[2]。目前手术仍然是根治胰腺癌的首要手段，但只有不到20%的胰腺癌患者适合接受手术治疗。即使施行多学科综合治疗，进展期胰腺癌患者的中位生存时间仍只有6个月左右[3]。鉴于胰腺癌恶性程度高、早期诊断难、易发生局部浸润和全身转移，因此，深入探索胰腺癌发生发展的分子机制显得尤为重要[4]。近年来，有关lncRNA在胰腺癌发生、发展和转移等生物学过程及在胰腺癌诊断、治疗等临床实践中的作用得到了越来越多的关注[5-6]。

虽然lncRNA种类和数量众多，但与其他非编码RNA相比，其研究仍处于起步阶段。人类DNA元件百科全书计划（Encyclopedia of DNA Elements，ENCODE）揭示，约有一万个人类基因座可以编码lncRNA[7]。lncRNA曾被长期认为是转录过程中的“噪音”，但近年来的研究[8]显示，lncRNA在基因表达的各个环节均起着重要的调控作用，与包括肝癌、前列腺癌、乳腺癌、结肠癌、胰腺癌、肺癌等在内的多种肿瘤的发生发展密切相关。深入了解lncRNA在胰腺癌与胰腺正常组织中表达的差异、lncRNA对胰腺癌的作用及其具体作用机制，在胰腺癌的早期诊断和治疗方面有着广阔的临床应用前景。

1 IncRNA的特点与功能

lncRNA是一类长度大于200个核苷酸的非编码RNA。与mRNA相比，大多数lncRNA同样由RNA聚合酶Ⅱ催化转录而来，结构中存在5’端帽结构和3′端Poly（A）尾，但lncRNA中不存在开放读码框，其序列保守程度不高且表达水平较低，组织特异性也更高[9]。编码lncRNA的基因广泛分布于基因组中，按照其模板的位置和特点的不同，lncRNA可以分为五种类型：正义长链非编码RNA（sense lncRNA）、反义长链非编码RNA（antisense lncRNA）、双向长链非编码RNA（bidirectional lncRNA）、内含子型长链非编码RNA（intronic lncRNA）和基因间长链非编码RNA（long intergenic non-coding RNA，lincRNA）[10]。lncRNA的功能依赖于其二级结构的完整性，如母系表达基因3（maternally expressed 3，MEG3）只有折叠成热力学稳定的二级结构时才能发挥出其肿瘤抑制功能[11]。另外，多数有功能的lncRNA都是被聚腺苷酸化的，仅少数没有被聚腺苷酸化仍有生物学功能，如as-Oct4-pg5和BC200[12-13]。

近年来的研究[14-15]表明，lncRNA参与了表观遗传调节、X染色体沉默、基因组印记，以及染色质修饰、转录激活、转录干扰、核内运输等多种重要的调控过程。Yang等[16]利用计算机算法绘制了66种lncRNA与193种疾病之间的关系图，揭示了lncRNA可能起到的广泛作用，说明非编码RNA与疾病间存在着复杂的调控网络。Wang等[17]将lncRNA的作用机制归纳为四种模型：①作为信号分子反映转录因子及其下游信号通路对基因的调控[18]；②作为诱饵绑定转录因子或其他蛋白，阻止其与特定DNA序列结合；③作为向导招募修饰特定基因的酶类；④作为支架将多种蛋白合成核糖核蛋白复合体。lncRNA也可以作为结构组分发挥作用，即作为小分子RNA（如m icroRNA、piRNA）的前体分子。

2 IncRNA与胰腺癌

目前人们已经认识到lncRNA在多种疾病包括肿瘤中都存在异常表达，提示其可能在疾病发生发展中发挥作用[19]，如前列腺癌相关转录物1在直肠癌、转移性前列腺癌中都存在高表达，提示其与恶性肿瘤远处转移有关[20]；lincRNA-p21则在P53信号通路中发挥抑癌作用[21]。在胰腺癌中，Tahira等[5]用基因芯片技术检测了38例胰腺癌组织和癌旁组织，证实了内含子型lncRNA在胰腺癌中表达有明显异常，包括PPP3CB、MAP3K14和DAPK1等；同时发现在胰腺癌转移样本中异常表达的lncRNA大部分与MAPK通路有关，提示lncRNA的作用机制与MAPK通路有关。而Wang等[22]筛选了与Wnt通路有关的八种lncRNA（包括lincRNA1611、ENSMUST00000052615、ENSMUST00000122008、ENSMUST00000110798、ENSMUST00000119417、ENSMUST 00000170943、ENSMUST00000120497及ENSMUST00000056452）和五种蛋白编码基因（Rhoa、Ruvbl1、Rac1、Ppp3ca及Ppp3cb)，发现lincRNA1611和Ppp3CA在胰腺导管腺癌和Ⅲ级胰腺上皮内瘤变中的表达明显上升。BC008363是新近发现的在胰腺癌中高表达的lncRNA，其表达通常代表着良好的预后[23]。随着生物基因芯片、CHIRP-Seq/ chip高通量测序、lncRNA与蛋白互作（RNA-protein pull down）[24]和免疫共沉淀等研究技术的不断发展，大量与胰腺癌有关的lncRNA不断地被筛选出来，但目前仅有少数lncRNA被研究得较为清楚。

2.1 IncRNA与胰腺癌的发生

胰腺癌的发生可能与多种基因的突变有关，如p53基因、K-ras基因、APC基因等，其中致癌基因K-ras的突变在胰腺癌的发生中发挥着重要作用[24]，其突变激活ERK、PI3K/Akt、MAPK和PKC等一系列信号通路，改变细胞代谢和增殖方式，促进胰腺癌发生。C-myc是K-ras调控的信号通路下游分子，也参与胰腺癌的发生发展等过程[25]。同样，在大多数胰腺癌细胞中均存在p53基因的突变[26]，p53是一个重要的肿瘤抑制基因，与维持基因组完整性有关。受DNA损伤刺激后，p53基因稳定表达P53蛋白，促进一种转录反应的发生，使细胞处于静息状态或者凋亡[27]。在这一转录反应中，很多lincRNA被P53蛋白依赖的途径激活：在MEF和K-ras系统中各有38和32种lincRNA被诱导表达，其中11种是相同的[21]。这些lincRNA均有可能参与并在p53基因驱动的肿瘤发生过程中发挥作用。

胰腺癌的发生是一个多因子参与的极其复杂的过程，近年来陆续发现了许多lncRNA参与到这一过程中并发挥重要的作用，其中大部分与p53基因、K-ras基因的下游调控分子C-myc基因的调控过程有关。

2.1.1 PVT1 全基因组关联研究发现，lncRNA浆细胞瘤变异易位体1（plasmacytoma variant translocation 1，PVT1）是胰腺癌易感性相关位点之一[28]。在染色体8q24.21区，PVT1与myc基因的位置很接近，位于其下游57 kb处，并向端粒方向延伸超过200 kb，形成了一个myc基因激活的染色体易位断点。PVT1与myc基因的共扩增被证实与多种肿瘤发生有关，如伯基特淋巴瘤、浆细胞瘤、卵巢癌、乳腺癌、肝癌和肺癌等[29-30]，但PVL1调节基因表达的具体机制尚不明确。

此外，还有许多以类似机制在其他肿瘤发生过程中起到作用的lncRNA。Huarte等[21]发现lincRNA-p21是P53蛋白的直接转录靶点，P53蛋白能结合到lincRNA-p21的启动子上，激活其表达。表达增加的lincRNA-p21与hnRNP-K物理性结合，帮助其定位到受p53蛋白调控的基因的启动子上，从而抑制靶基因的转录，调控细胞凋亡。另外，MEG3能激活p53基因，选择性调控p53靶基因表达[16]。当p53基因发生突变时，可能加快胰腺癌发生进程。lncRNA ANRIL则能通过介导INK4b-ARF-INK4a位点的基因沉默在肿瘤发生中发挥作用[12]。虽然以上lncRNA在胰腺癌中是否也能发挥类似作用仍有待实验证实，但是不同部位肿瘤发病机制之间存在共通点，可以据此推测出其对胰腺癌的作用。

2.1.2 gas5 虽然目前研究的大部分lncRNA都与促进恶性肿瘤的发生和进展有关，但也有部分lncRNA具有抑癌作用。生长抑制特异性基因5（grow th arrest-specific gene 5，Gas5）定位于染色体1q25.1区，其在胰腺癌组织中的表达明显比正常胰腺组织低。体外实验[23]也证实，在胰腺癌PANC-1和BxPC3细胞系中，gas5能使癌细胞停滞在细胞周期的S期，从而抑制癌细胞增殖。这一作用是通过降低周期素依赖性激酶的表达来实现的。gas5发挥抑癌作用的机制十分复杂，仍需进一步探究。

2.2 IncRNA与胰腺癌的转移

与肿瘤发生类似，胰腺癌的转移过程同样是多基因参与调控的复杂过程。早在2008年全基因组分析就已找到了数百种与胰腺癌转移相关的编码基因[31]。近年来，lncRNA在肿瘤转移中的作用越来越受到重视，相关lncRNA的作用也得到了深入的研究。

2.2.1 HOTAIR HOX反义基因间RNA（HOX antisense intergenic RNA，HOTAIR）是第一个被发现与胰腺癌有关的lncRNA分子，由2185个核苷酸组成，位于染色体12q13.13的HoxC位点。HOTAIR是由Rinn等[32]于2007年首次发现并描述，是第一个被发现以反式转录干预基因表达的lncRNA，也是目前研究较全面的lncRNA。

HOTAIR有分子骨架的作用，能同时结合两种不同的组蛋白修饰复合体，并可能起到协调两者功能的作用。其5′端与多梳抑制复合体2的核心组成部分之一EZH2结合，可使组蛋白H3第27位的赖氨酸三甲基化；而3′端与组蛋白去甲基化酶复合体（LSD1/CoREST/REST）结合，可使组蛋白H3第4位的赖氨酸去二甲基化[33]，从而引起HOXD基因座表达沉默，使染色质凝聚形成兼性异染色质[34]。

HOTAIR的表达升高会增加多种类型肿瘤细胞的侵袭和转移能力，包括肝癌、乳腺癌、结肠癌等[35-37]。Stratford等[35]的研究发现，HOTAIR的表达水平与胰腺癌的T、N分期呈正相关。生存率分析表明，HOTAIR低表达的患者总体生存率明显高于高表达者。最近，Kim等[38]通过基因分析发现，HOTAIR在胰腺癌中的表达比在癌旁组织中的明显升高，HOTAIR高表达的胰腺癌患者总体肿瘤侵袭与转移范围更广，预后多不良。敲除Panc1和L3.6pL胰腺癌细胞系中的HOTAIR可以降低细胞增殖和侵袭能力，改变细胞周期并诱导凋亡[38]。

2.2.2MALAT1 人肺腺癌转移相关转录物1（metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript-1，MALAT1）是最初在非小细胞肺癌中被发现的一种lncRNA，之后又被证实存在于乳腺癌、大肠癌、胰腺癌等恶性肿瘤中。MALAT1能使富含丝氨酸、精氨酸的剪接因子磷酸化，从而影响剪接因子的分布，使特定组织或细胞内的mRNA前体选择性剪接，并参与转录后水平的调控[39]。Liu等[6]的研究分析表明，MALAT1在胰腺癌组织中高表达，且表达水平与肿瘤大小、肿瘤分期及浸润深度有明显关联，说明其与胰腺癌转移呈密切相关。

此外，MALAT1还能与多聚嘧啶序列结合蛋白相关剪接因子作用，以诱导原癌基因GAGE6的表达[40]，其作用机制及与胰腺癌等肿瘤发生的关系仍有待探究。

2.3 IncRNA与胰腺癌的治疗

目前胰腺癌的治疗以手术治疗和化疗为主。通过研究非编码RNA的表达失调及其调控机制，研发药物下调异常表达的RNA或设计药物替代表达降低的RNA，可以为胰腺癌提供新的治疗靶点。

H19是目前最早应用于胰腺癌治疗的lncRNA。BC-819是一种能够在H19的调控下表达白喉毒素A链的质粒载体，具有抗肿瘤的作用[44]。BC-819最初试用于膀胱癌的治疗，其被机体摄取后在细胞中表达大量白喉毒素，在人体临床试验中可造成肿瘤体积缩小[41，44-46]。随着临床试验的广泛开展，BC-819应用的有效浓度和剂量也得到了进一步确定。在此基础上，Sorin等[46]将胰腺癌一线化疗药物吉西他滨与BC-819联合应用于胰腺癌动物模型中，并取得了较好的疗效。

此外，PVT1与胰腺癌对吉西他滨的敏感性有直接关系，在人胰腺癌细胞系ASPC-1中，降低PVT1活性可以提高对吉西他滨的敏感性[30]。

3 展望

非编码RNA是近几年逐渐兴起的研究热点，它拓展了学者们对基因组学的认识。与研究得较为成熟的m icroRNA相比，如今学者们对lncRNA仍然知之甚少，研究多数处于观察其在特定类型肿瘤中表达异常现象的情况，而具体作用机制和在肿瘤中所起到的作用依然没有深入的了解。随着RNA测序技术和生物信息学的不断发展，学者们将会对lncRNA的种类、结构和功能有进一步的认识。

除此以外，lncRNA在胰腺癌诊断和治疗中有着广泛的临床应用前景。胰腺癌通常发病隐匿，早期常无特异性症状。虽然某些lncRNA已被证明与胰腺癌的发病相关，但是缺乏特异性或难以检测，离临床应用还有一段距离。若能在血液、排泄物等易获得的标本中检测特定lncRNA表达含量的差异，就可以为胰腺癌的早期诊断、肿瘤分期提供依据。同样，如今依然没有能够对胰腺癌有显著治疗效果和高选择性的药物，全基因组序列的分析揭示了更多非编码RNA的功能。针对表达异常的特定调控RNA设计的靶向治疗药物有望提高胰腺癌的预后，从而提高患者的生活质量。

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R735.9

A

10.11877/j.issn.1672-1535.2015.13.02.10

国家自然科学基金面上项目（81172030）；上海交通大学医学院大学生创新性实验项目（2014059）

*两位作者对本文贡献等同

#通信作者（corresponding author），e-mail：tl09168@hotmail.com

2014-11-19）