靶向递药系统长循环脂质体的研究进展

胡晓静，苏 峰，何广卫

(1.安徽中医药大学，安徽合肥 230012;2.合肥医工医药有限公司，安徽合肥 230088)

目前癌症仍是一类死亡率高且无法治愈的疾病［1］。现如今药物的保守治疗仍占重要地位，但普通剂型的抗肿瘤药物因靶向性差，体内呈全身性分布而引发一系列不良反应，导致化疗失败。近年来临床上已有一些抗肿瘤靶向制剂的新剂型，能实现抗癌药物的定位释放、减少毒副作用、提高抗癌效果，如脂质体、白蛋白纳米粒、微乳等［2］。尽管这些新技术的出现取得了一定的疗效，但仍存在一些局限:白蛋白纳米粒中人血清来源有限、牛血清会产生轻度免疫反应;微乳中的表面活性剂和助表面活性剂具有潜在胃肠道刺激性和全身慢性毒性倾向。故此，更多的研究者将目光投向了脂质体，以期实现更好的治疗效果。

脂质体的出现已经有50余年的历史，其粒径在25～2 500 nm之间［3］，处于纳米级别的脂质体，因其具有粒径小、比表面积大的性质，使得脂质体负载更多的药物透过血液屏障到达靶器官成为可能。但是普通脂质体存在以下问题:贮存过程中易发生氧化、分层、泄漏等稳定性大大降低的现象;进入血液循环后易被网状内皮细胞吞噬。而长循环脂质体因能够避免网状内皮系统的快速吞噬、阻断肿瘤组织血管新生、增强在肿瘤组织中的渗透与滞留、与肿瘤细胞特异性结合等而发挥较好的抗肿瘤作用，造福人类。本文对长循环脂质体及其制备方法、质量评价、药动学及药效学等进行综述如下。

1 长循环脂质体概念

长循环脂质体是指脂质体经表面修饰，达到定位、浓集、缓释、保护、体内可生物降解的一类脂质体。目前长循环脂质体的修饰物有:神经节苷脂GM1、非离子表面活性剂、聚乙二醇(PEG)及其类脂衍生物等。其中PEG及其类脂衍生物因来源广泛且无免疫毒性等，成为目前常用的长循环表面修饰物，主要包括 PEG-DSPC、PEG-PE、PEG-DSPE、PEGPC等。修饰后的脂质体可因PEG分子中大量的亲水基团与水结合构成空间位阻，降低网状内皮系统(RES)的识别和吞噬概率，使有效的血药浓度长时间作用于靶组织或靶细胞中，提高治疗效果［4］。

2 长循环脂质体的制备工艺

长循环脂质体的制备方法包括薄膜分散法、逆向蒸发法、乙醇注入法等。

2.1 薄膜分散法 薄膜分散法是指将膜材溶于适量有机溶剂并经减压旋转，有机溶剂挥发完全后加入含药缓冲溶液，水化成均匀脂质膜，经探头超声，过膜整粒，得长循环脂质体混悬液，充入N2，4℃密封保存。对于脂溶性药物多选此法。但是选用薄膜分散法制备的脂质体粒径一般较大(＞1μm)，若结合高压均质法，能很好地降低脂质体粒径。现引申的方法包括薄膜分散—高压匀质法、薄膜分散—硫酸胺梯度法等。

陈宇潮等［5］采用薄膜分散—高压均质法制备多烯紫杉醇长循环脂质体(DPL)，通过单因素实验证实了当均质压力为50 MP，均质次数为3次时，所制备的DPL粒径较小且分布均匀、包封率较高。刘艳芳等［6］以薄膜分散法结合硫酸铵梯度法制备了含表阿霉素和白藜芦醇的复方长循环脂质体(PEGEPI-RES-L)，其外观呈淡蓝色乳光。丁达尔现象明显。与普通脂质体相比，两种药物的包封率和稳定性均明显提高。体外释放度实验显示PEG-EPIRES-L较其普通脂质体(EPI-RES-L)和原料药(EPI+RES)释药速度明显缓慢。体外细胞毒试验证明，PEG-EPI-RES-L组平均细胞存活率远低于EPI-RESL组和EPI+RES组，表现出了较强的抗肿瘤活性。

2.2 乙醇注入法 乙醇注入法系将成膜材料与PEG、难溶性药物溶于乙醇溶液中，作为有机相，将磷酸盐缓冲液作水相。在水浴、搅拌的条件下，将有机相匀速注入缓冲溶剂中，挥去有机溶剂至无醇味，静置，过一定大小的微孔滤膜。4℃冰箱保存。该法工艺简单、重复性好且有机溶剂的使用量少，较为常用。

尤佳等［7］利用乙醇注入法制备了姜黄素长循环脂质体(Cur-LCL)，其粒径分布均匀、粒子间无黏连、聚集现象。对其稳定性进行考察发现，在4℃密封放置3个月后，包封率无显著变化、稳定性较好。同时体外模拟释药结果表明Cur-LCL药物持续稳定释放达24 h以上，表明Cur-LCL具有长循环作用。

2.3 逆向蒸发法 逆向蒸发法是将含药的水溶液加入到含有磷脂等膜材、修饰物的有机溶剂中后，探头超声成乳液，经减压蒸发除去有机溶剂，所得混悬液挤压过膜。4℃冰箱保存，即可。此法所得的长循环脂质体大小均匀，对水溶性药物包封率较高［8］。

Cheraga Nihad等［9］采用逆向蒸发法制备了Mpeg2000-DSPE修饰的奥沙利铂长循环脂质体，并分别通过0.8、0.45 和 0.22 μm 聚碳酸酯滤膜，所得脂质体在透射电子显微镜下呈球形结构、大小均匀、粒度分布较小、平均粒径约为204 nm，同时体外模拟释药拟合呈一级模型。王翠艳等［10］采用逆向蒸发法制备的米托蒽醌长循环脂质体，其粒径范围在83～199 nm之间。荷瘤鼠体内药物分布显示，米托蒽醌长循环脂质体体内循环时间高于普通脂质体，肝、肺分布率也高于普通脂质体，为米托蒽醌长循环脂质体的临床抗癌研究提供依据。

3 长循环脂质体的质量评价

3.1 长循环脂质体的外观及表面形态 观察理想的长循环脂质体外观应具备以下特征:粒径分布均匀、颗粒间分散较好、连续呈圆形或椭圆形等。这样可使药物易于浓集于靶部位，提高治疗指数。形态观察可先采用磷钨酸染色液进行负染后，透射电子显微镜测定。粒径及粒度分布采用激光散射粒度分析仪进行测定。由于制备方法不同，所得的粒径也有所差异。

方瑜等［11］以制备的粒径为20 nm的Fe3O4为磁性材料，聚乙二醇单甲醚(mPEG)为修饰剂制备了盐酸表柔比星长循环磁性脂质体。2%磷钨酸负染，透射电镜观察表面近球形，平均粒径为50 nm，包封率达57.5%。谢向阳等［12］以pH梯度法研制了重酒石酸长春瑞滨长循环脂质体，采用Mas-tersizer2000粒度分析仪测得平均粒径为(96.4±27.2)nm。透射电镜观察显示，粒子大小分布均匀、无聚集现象。

3.2 长循环脂质体的载药量和包封率 优良的长循环脂质体应当具备良好的载药能力、药物包封能力及稳定性。通常认为，载药量越高越好。同时也要结合药物在血中的稳定性来确定适当的载药量，使药效发挥最好。但由于脂质体易出现渗漏现象，因此，在脂质体的研究中包封率是质量控制的重要指标之一。影响药物的包封率大小的因素主要包括长循环脂质体制备过程中的处方因素及工艺因素。吴燕等［13］证明了当选择磷脂浓度为75 g·L－1、药脂比为1∶30时，表柔比星长循环热敏脂质体包封率较高。有文献报道当增加均质压力时，多紫杉醇长循环脂质体粒径减少，包封率下降［5］。对于长循环脂质体包封率的测定，通常采用一定的方法，如凝胶柱色谱法、超滤法、鱼精蛋白沉淀法、有机溶剂法、萃取法、透析法等将长循环脂质体中包封药物与游离药物分开，再以适当的方法直接或间接的测定。

陈道阳等［14］采用葡聚糖凝胶－G50微型柱法分离川芎嗪长循环脂质体和游离药物，并以高效液相色谱法直接测定川芎嗪长循环脂质体的包封率。结果当采用色谱柱径高比为15 cm∶0.8 cm、洗脱液流速为 0.5 mL·min－1、上样量为0.25 mL 时，川芎嗪长循环脂质体先被洗脱，且与未包封游离药物被洗脱间隔有3 mL的洗脱量，表明了葡聚糖凝胶－G50微型柱能够将川芎嗪长循环脂质体和游离药物完全分离。同时计算出的川芎嗪长循环脂质体平均包封率为81.45%。赵利刚等［15］采用超滤法将酒石酸长春瑞滨(VBT)长循环脂质体混悬液置超滤管中离心60 min，HPLC法测得VBT长循环脂质体的包封率，同时考察了离心时间、膜截留相对分子质量、脂质浓度对包封率测定的影响。喻樊［16］报道了以鱼精蛋白沉淀法间接地测定绞股蓝总皂苷长循环脂质体的包封率为74.4%。同时许磊磊等［17］证实了不同处方工艺所得的包封率也不同。

3.3 长循环脂质体稳定性 研究纳米粒的稳定性是影响药效的重要原因。长循环脂质体混悬液在贮存期间会发生稳定性降低现象如絮凝、药物渗漏等。因此对脂质体的稳定性进行研究有着十分重要的意义。长循环脂质体稳定性考察指标有很多，如外观、粒径、表面电位、含量、磷脂的氧化指数等。同时在体内血液中的多种成分均可不同程度地破坏长循环脂质体，造成药物渗漏。如:高密度脂蛋白、血清白蛋白、血液中的磷脂酶等。因此，有必要对长循环脂质体渗漏率进行测定。

牛凤菊等［18］采用高效液相法分别对置冰箱(4℃)和室温(25℃)保存下的含长春碱的长循环阳离子脂质体进行渗漏率的测定。结果表明，脂质体在25℃保存60 d时的渗漏率明显高于4℃条件的情况。说明了存温度会影响脂质体的渗漏率。此外，李伟超［19］通过光照、温度及加速实验考察了β-榄香烯长循环脂质体的稳定性，证实了榄香烯长循环脂质体需低温避光保存，以防止药物渗漏。

4 长循环脂质体药物动力学、药效学研究

长循环脂质体是一种基于纳米级的给药靶向制剂，载药纳米粒可以从肿瘤间隙的内皮组血管中逸出而进入肿瘤发挥疗效，改变了药物的体内组织分布和体内代谢行为。对抗肿瘤药物在动物体内的药物动力学及药效学研究，可为临床研究提供有力的理论意义。

时军等［20］采用卵磷脂、胆固醇、PEG2000-DSPE摩尔比为10∶5∶0.3制备足叶乙苷长循环脂质体。小鼠体内药代动力学显示，长循环脂质体的消除半衰期和药时曲线下面积(AUC)分别是注射剂的17倍和3.5倍。冯丽萍等［21］比较了川芎嗪的长循环脂质体和普通脂质体在SD大鼠体内的药代动力学发现，川芎嗪的长循环脂质体的消除半衰期约是普通脂质体的10倍，AUC大约是普通脂质体的4倍。周蔚等［22］通过对荷瘤裸鼠尾静脉注射紫杉醇注射液、空间稳定性紫杉醇脂质体(SSL-PTX)、主动靶向肺癌的空间稳定性紫杉醇脂质体(T-SSL-PTX)，考察各剂型中紫杉醇药代谢动力学行为。结果6 h后紫杉醇注射液组几乎检测不到有效药物浓度，而SSL-PTX及T-SSL-PTX组在9 h后仍测出较高浓度。表明了长循环脂质体能够延长药物在体内循环时间，便于药物从血液循环分布到靶部位。

奥沙利铂临床上常用于治疗多种癌症的铂类抗癌药物，白细胞减少是其常见的不良反应。李哲等［23］采用乙醇注入法研制了载有奥沙利铂的长循环脂质体(OLCL)，并考察其在S180荷瘤小鼠体内的药效学，发现与生理盐水组相比，奥沙利铂溶液组的白细胞计数、脾脏指数和胸腺指数明显降低，而OLCL组无明显变化;但奥沙利铂长循环脂质体的抑瘤率为 85.8%，远远高于奥沙利铂溶液组30.4%。表明了长循环脂质体能够减少对白细胞的杀伤、降低免疫系统的毒性。Pi等［24］以等剂量小鼠静脉注射丹酚酸B注射液、丹酚酸B普通脂质体和丹酚酸B长循环脂质体，并以超高效液相色谱串联质谱法(ULPC-MS/MS)测定各组织中的浓度。组织实验表明，在注射240 min后仍能在肝、脾、肺等组织中测到丹酚酸B长循环脂质体的有效的血药浓度。Shavi等［25］采用薄膜分散法制备了阿那曲唑普通脂质体和经PGE修饰的阿那曲唑长循环脂质体，Wistar大鼠体内实验结果表明，阿那曲唑长循环脂质体和普通脂质体的AUC分别是阿那曲唑原料药的3.33和20.28倍，表明了阿那曲唑长循环脂质体能够发挥长循环及缓释性，在乳腺癌的治疗中具有明显优势。

在长循环脂质体表面连接一些能够特异性或非特异性结合靶细胞的分子，它们能够与靶部位相结合，发挥良好疗效。马哲松［26］通过体外细胞摄取实验和细胞毒性实验发现，精氨酸—甘氨酸—天冬氨酸(RGD)修饰紫杉醇长循环脂质体(PTX-RGDLPs)组的肿瘤细胞定向摄取率高于普通脂质体的3.1倍，细胞毒性高于紫杉醇溶液组和普通紫杉醇脂质体组，说明了经 RGD修饰可显著富集靶向于肿瘤组织，提高药物疗效。江峰等［27］以曲妥珠单抗(TMAB)修饰得阿霉素免疫脂质体(DOX-IML)，体外释放实验研究表明，DOX-IML在12 h内药物累积释放量达40%，72 h达释放平衡。表明DOX-IML具有一定的缓释性。细胞毒性实验显示:阿霉素免疫脂质体的细胞毒性大于阿霉素脂质体。表明TMAB能够提高阿霉素脂质体的主动靶向性，提高了阿霉素的抗肿瘤活性，减少了对其它正常细胞的毒副作用。

5 长循循环脂质体的展望

近年来，依赖纳米给药系统的肿瘤治疗越来越受到关注，将纳米技术应用于肿瘤早期的预防、诊断、以及综合治疗等方面，已成为国际上重要的新兴学科方向［28］。长循环脂质体因具有体内长循环、靶向、保护、高效低毒等特性，极大地解决了脂质体作为纳米给药载体的不足而倍受青睐。如它可作化疗药物的载体(如紫杉醇、多柔比星、顺铂等);可作基因治疗的非生物载体;可长时间富集于病灶，支持某些慢性疾病的治疗。此外，经PEG修饰的长循环脂质体，能够接入抗体、多肽、多糖、叶酸而增加与肿瘤表面的亲和力，也有研究报道过以肿瘤细胞内的线粒体为靶点来诱导细胞凋亡［29］。

尽管如此，随着研究的深入，近年来发现PEG化脂质体也存在相应的负面影响，也就是所谓的PEG“窘境”(PEG dilemma)，如皮下或静脉注射PEG化脂质体引起的加速血液清除(Accelerated blood clearance，ABC)现象［30－31］、妨碍 pH 敏感脂质体细胞内的“核内体逃逸”现象等［32］。虽然动物体内药效学及药动学研究证实长循环脂质体具有长循环、缓释、靶向等效果，但实验室动物模型的药动学的研究对象并不能完全代表人体的临床实际应用。目前，长循环脂质体的研究主要集中于实验室的摸索，上市的药物并不多。因此，对于制备出收率更高，质量稳定性更好，所需生产成本更低的长循环脂质体，还需要后续更多药学工作人员的不断努力。

［1］Thamb Ti，Park JH.Recent Advances in Shell-Sheddable Nanoparticles for Cancer Therapy［J］.Journal of Biomedical Nanotechnology，2014，10(9):1 －22.

［2］王梦迪，何广卫.靶向递药系统白蛋白纳米粒的研究进展［J］.安徽医药，2013，17(10):1649 －1651.

［3］Akbarzadeh A，Rezaei-Sadabady R，Davaran S，et al.Liposome:classification，preparation，and applications［J］.Nanoscale Res Lett，2013，8(1):102 －111.

［4］Kraft JC，Freeling JP，Wang Z，et al.Emerging Research and Clinical Development Trends of Liposome and Lipid Nanoparticle Drug Delivery Systems［J］.J Pharm Sci，2014，103(1):29 －52.

［5］陈宇潮，程 怡，仝一丹，等.多烯紫杉醇长循环脂质体的制备工艺优选及体外释放性能考察［J］.中国实验方剂学杂志，2014，20(12):6 －10.

［6］刘艳芳，袁苗苗，轩亚茹，等.表阿霉素－白藜芦醇长循环脂质体的制备及其体外释放［J］.临床和实验医学杂志，2014，13(15):1228－1231.

［7］尤 佳，戴东波，何雯洁，等.姜黄素长循环脂质体的制备及药动学研究［J］.中国中药杂志，2014，39(7):1238 －1242.

［8］胡鹏翼，吴 清，郑 琴，等.槐定碱热敏脂质体的制备工艺研究［J］.中草药，2014，45(3):349 －354.

［9］Cheraga Nihad，沈 雁，涂家生.Taguchi正交法优化奥沙利铂长循环脂质体的制备［J］.药学研究，2014，33(4):187 －191.

［10］王翠艳，李占山，张 锦，等.米托蒽醌长循环脂质体的制备及特性［J］.中国疗养医学，2013，22(4):363 －364.

［11］方 瑜，陈 进，吴询燊，等.盐酸表柔比星长循环磁性脂质体的制备及表征［J］.江苏大学学报(医学版)，2013，23(3):254－258.

［12］谢向阳，陈 晨，林 雯，等.重酒石酸长春瑞滨长循环脂质体的制备与表征［J］.医药导报，2015，34(3):379 －384.

［13］吴 燕，吴 诚，梅兴国，等.盐酸表柔比星长循环热敏脂质体的处方优化及体外释药考察［J］.中国药学杂志，2010，45(9):677－681.

［14］陈道阳，陈晓丹，王利胜.川芎嗪长循环脂质体包封率的测定［J］.中国医药导报，2013，10(14):114 －116.

［15］赵利刚，杨清敏，杨光丽，等.酒石酸长春瑞滨长循环脂质体的包封率测定及药效研究［J］.中国药科大学学报，2010，41(6):508－512.

［16］喻 樊.绞股蓝总皂苷脂质体的制备与表征［J］.中草药，2013，44(18):2526 －2530.

［17］许磊磊，陈宪智，李亚平，等.硫酸铵梯度法制备盐酸拓扑替康脂质体及其在大鼠体内的药动学［J］.中国医药工业杂志，2014，45(12):1139 －1142.

［18］牛凤菊，周祉延，李学涛，等.长春碱亲水基修饰阳离子脂质体制备及理化性质测定［J］.中国实验方剂学杂志，2014，20(20):17－20.

［19］李伟超.β－榄香烯长循环脂质体的研制及药物动力学研究［D］.武汉:武汉理工大学，2010.

［20］时 军，程 怡，陈伟鸿，等.足叶乙苷长循环脂质体的小鼠代谢动力学研究［J］.中国药学杂志，2010，45(16):1247 －1249.

［21］冯丽萍，李文锋，陈晓丹.川芎嗪长循环脂质体与普通脂质体在大鼠体内的生物利用度研究［J］.广东药学院学报，2014，30(2):150－152.

［22］周 蔚，周彩存，孟淑燕，等.靶向肺癌的紫杉醇长循环脂质体抑瘤作用研究［J］.肿瘤，2011，31(3):203 －209.

［23］李 哲，马海英.奥沙利铂长循环脂质体的制备及其在小鼠体内的药效学研究［J］.药学服务与研究，2015，15(1):27 －31.

［24］Pi J，Liu Z，Shu L，et al.Tissue distribution study of salvianolic acid B long-circulating liposomes in mice byUPLC-MS/MS determination［J］.Pak JPharm Sci，2015，28(1):213 －220.

［25］Shavi GV，Reddy MS，Raqhavendra R，et al.PEGylated liposomes of anastrozole for long-term treatment of breast cancer:in vitro and in vivo evaluation ［J］.J Liposome Res，2015［Epub ahead of print］.

［26］马哲松.RGD修饰紫杉醇脂质体靶向抑制肝癌 HepG2细胞［J］.胃肠病学和肝病学杂志，2014，23(7):803 －806.

［27］江 峰，陈江浩，杨铁虹，等.曲妥珠单抗修饰的阿霉素免疫脂质体的制备及体外性质研究［J］.现代生物医学进展，2014，14(21):4022－4028.

［28］房 坤，杨 芳，顾 宁.携带磁性纳米颗粒载药微囊的制备及肿瘤治疗的应用研究进展［J］.中国肿瘤临床，2014，41(1):9 －12.

［29］Zhou J，Zhao WY，Ma X，et al.The anticancer efficacy of paclitaxel liposomes modifiedwith mitochondrial targeting conjugate in resistant lung cancer［J］.Biomaterials，2013，34(14):3626 －3638.

［30］Abu Lila AS，Nawata K，Shimizu T，et al.Use of polyglycerol(PG)，instead of polyethylene glycol(PEG)，prevents induction of the accelerated blood clearance phenomenon against long-circulating liposomes upon repeated administration［J］.Int J Pharm，2013，456(1):235 －242.

［31］Yang Q，Ma Y，Zhao Y，et al.Accelerated drug release and clearance of PEGylatedepirubicin liposomes following repeated injections:a new challenge for sequential low-dose chemotherapy［J］.Int J Nanomedicine，2013，8:1257 －1268.

［32］张 迪，徐 缓，胡美娜，等.脂质体面临的聚乙二醇“窘境”及其解决方法［J］.药学学报，2015，50(3):252 －260.