线粒体丝氨酸蛋白酶在甲状腺乳头状癌中的表达水平及其临床意义

关如花，房辉，徐刚，杨莹，杨梅柳，张翠林，周莉，李玉凯，周蕾，张雅中，田金莉，杨岳

（1.华北理工大学，河北 唐山 063000；2.河北省唐山市工人医院内分泌科，河北 唐山 063000；3.河北医科大学，河北 石家庄 050000）

·临床论著·

线粒体丝氨酸蛋白酶在甲状腺乳头状癌中的表达水平及其临床意义

关如花1，房辉2，徐刚2，杨莹2，杨梅柳2，张翠林1，周莉1，李玉凯3，周蕾2，张雅中2，田金莉2，杨岳2

（1.华北理工大学，河北 唐山 063000；2.河北省唐山市工人医院内分泌科，河北 唐山 063000；3.河北医科大学，河北 石家庄 050000）

目的探讨线粒体丝氨酸蛋白酶（Omi/HtrA2）在甲状腺乳头状癌中的表达及其与临床病理的关系。方法采用免疫组织化学方法和蛋白印迹法检测120例甲状腺乳头状癌、40例结节性甲状腺肿及40例正常甲状腺组织中Omi/HtrA2的表达水平，并分析其与甲状腺乳头状癌的临床病理特征的关系。结果免疫组织化学结果表明，甲状腺乳头状癌组织中Omi/HtrA2蛋白阳性率（71.67%）较结节性甲状腺肿（30.00%）、正常甲状腺组织（32.50%）明显升高，差异有统计学意义（P＜0.05）。蛋白印迹法检测结果表明，Omi/HtrA2蛋白在甲状腺乳头状癌组织中的表达量为（1.184±0.060），明显高于结节性甲状腺肿组织（0.599±0.096）和正常甲状腺组织（0.606±0.097），差异有统计学意义（P＜0.05）。Omi/HtrA2蛋白的表达与甲状腺乳头状癌的包膜浸润、淋巴结转移、肿瘤临床分期及肿瘤分化有关（P＜0.05）。结论Omi/HtrA2蛋白的表达可能成为判断甲状腺乳头状癌恶化程度及预后的指标。

甲状腺乳头状癌；线粒体丝氨酸蛋白酶（Omi/HtrA2）；免疫组织化学法；蛋白印迹法

甲状腺癌是最常见的内分泌肿瘤，约占内分泌肿瘤的90%[1]。而甲状腺乳头状癌又是甲状腺癌中最常见的类型，因此，尽早对其进行诊治具有重要意义。肿瘤细胞的生长受到许多因素的影响，细胞凋亡因子失衡与肿瘤的发生发展、浸润及转移密切相关。Omi/HtrA2是线粒体膜间隙释放的促凋亡因子，在多种组织和细胞中均有表达[2]。近期研究显示，O-mi/HtrA2在胃癌[3]、结肠癌[4]、食管癌[5]中都呈现高表达，但在甲状腺乳头状癌中的作用报道较少。本研究应用免疫组织化学方法和蛋白印迹法（Western-blot）检测Omi/HtrA2在甲状腺乳头状癌中的表达情况，为甲状腺乳头状癌的临床诊断及治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

收集唐山市工人医院2013年2月-2014年10月确诊的120例甲状腺癌患者的新鲜甲状腺乳头状癌组织标本以及40例结节性甲状腺肿和40例正常甲状腺组织标本，分为3组。120例甲状腺乳头状癌组中，男52例，女68例；＜45岁56例，≥45岁64例。其中，有包膜浸润的35例，无包膜浸润的85例；分化程度：低分化78例，高、中分化42例；按照2002年UICC（国际抗癌联盟）的TNM（T是原发肿瘤的大小、N是区域淋巴结是否有转移、M是是否有远处转移）进行分期：Ⅰ、Ⅱ期65例，Ⅲ、Ⅳ期55例；根据是否淋巴结转移分为：有转移者70例，无转移者50例。所有标本均在手术室现场收集，并征得患者及家属的同意，一部分组织置于液氮中保存，用于Western blot检测，其余组织置于10%甲醛溶液中固定，用于免疫组织化学法检测。全部标本均由2位病理科医生通过HE染色的切片明确病理诊断，病历资料均具有可比性。所有患者术前均无放疗或者化疗史。

1.2 主要实验试剂

免疫组织化学及Western blot试剂，兔抗人Omi/ HtrA2多克隆抗体购自北京博奥森生物技术有限公司。

1.3 实验方法及步骤

1.3.1 免疫组织化学组织标本经常规石蜡包埋，每份病理标本切成4μm厚的切片。石蜡切片进行常规二甲苯脱蜡，梯度乙醇脱水处理后，进行0.01 mol/L柠檬酸盐缓冲液（pH=6.0）及微波抗原修复。室温下将玻片放到盛有10%山羊血清的湿盒中封闭20 min，之后在玻片上滴加Omi/HtrA2兔抗人多克隆抗体（1∶100），盖上湿盒置于4℃冰箱中过夜。第2天室温下在玻片上滴加二抗，然后于湿盒内孵育10 min，孵育完毕后对玻片冲洗并进行二氨基联苯胺（DAB）显色，再进行苏木精复染，常规脱水，最后进行封片。结果判定：由2位病理科专家在不知临床病例资料的前提下，对阳性细胞所占的比例进行计数。以细胞浆呈现淡黄色或棕黄色染色颗粒作为阳性标准，计算10个高倍视野中阳性细胞所占的比例，结果判定以染色强度和阳性细胞百分率相乘得出的饱和指数（SI指数）进行评估。染色强度如下：没有染色（0分），弱度染色（1分），中度染色（2分）,强度染色（3分）。染色区域如下：肿瘤细胞少于25%（1分），25%～50%（2分），51%～75%（3分），＞75%（4分）。各因子的表达水平由SI指数决定，SI指数≥4为因子阳性表达，SI指数≤3为因子阴性表达。以磷酸盐缓冲液（PBS）代替一抗作阴性对照组。

1.3.2 Western blot方法将100 mg组织提取的总蛋白用考马斯亮蓝试剂盒定量。取50μg蛋白上样到配置好的SDS-PAGE凝胶，电泳，将凝胶上的蛋白电转移至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜，以50 g/L脱脂奶粉4℃封闭过夜，加一抗Omi/HtrA2兔抗人多克隆抗体（1∶100），37℃孵育2 h，0.1%TBST缓冲液漂洗PVDF膜3×10 min，取出PVDF膜加入二抗，37℃孵育2 h，TBST洗膜后加入ECL试剂，曝光、显影、定影，对X光底片拍照保存。

1.4 统计学方法

采用SPSS 17.0统计软件进行数据分析，计数资料的比较用χ2检验，多组计量资料的比较用方差分析，进行两两比较用q检验（Studnet-Newman Keuls检验法），P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Omi/HtrA2在甲状腺乳头状癌、结节性甲状腺肿及正常甲状腺组织中的表达情况

对甲状腺乳头状癌、结节性甲状腺肿和正常甲状腺组织进行HE染色，如图所示（见图1）。免疫组织化学结果显示，Omi/HtrA2阳性表达的甲状腺组织呈浅黄色、棕黄色或黄褐色（见图2）。甲状腺乳头状癌、结节性甲状腺肿及正常甲状腺组织中Omi/HtrA2的阳性表达率分别为71.67%（86/120）、30.00%（12/ 40）和32.50%（13/40）。甲状腺乳头状癌组Omi/HtrA2的阳性率明显高于结节性甲状腺肿组和正常甲状腺组，差异均有统计学意义（χ2=21.944和19.509，P＜0.05）；结节性甲状腺肿组与正常甲状腺组Omi/HtrA2的阳性率差异无统计学意义（χ2=0.058，P＞0.05）（见表1）。Western blot结果显示，Omi/HtrA2蛋白在甲状腺乳头状癌组织中的表达量为（1.184±0.060），明显高于结节性甲状腺肿组织（0.599±0.096）和正常甲状腺组织（0.606±0.097），差异均有统计学意义（P＜0.05），而其在结节性甲状腺肿组与正常甲状腺组间差异无统计学意义（P＞0.05）（见图3）。

图1 甲状腺组织的HE染色图像（×100）

图2 免疫组织化学检测Omi/HtrA2在甲状腺组织中的表达（×100）

表1 Omi/HtrA2在甲状腺乳头状癌、结节性甲状腺肿及正常甲状腺组织中的表达情况

图3 Western blot检测Omi/HtrA2蛋白的表达

2.2 Omi/HtrA2在甲状腺乳头状癌的表达与临床病理参数的关系

无包膜浸润患者Omi/HtrA2的阳性率明显高于有包膜浸润患者，差异有统计学意义（χ2=34.003，P＜0.01）；无淋巴结转移患者的Omi/HtrA2阳性率明显高于淋巴结转移患者，差异有统计学意义（χ2=6.421，P＜0.05）；Ⅰ、Ⅱ期临床分期Omi/HtrA2的阳性率明显高于Ⅲ、Ⅳ期临床分期患者，差异有统计学意义（χ2=11.710，P＜0.01）；高、中分化患者Omi/HtrA2的阳性率明显高于低分化，差异有统计学意义（χ2= 6.280，P＜0.05）。Omi/HtrA2的阳性率与患者的性别、年龄、是否合并桥本甲状腺炎和发生部位无关，组间差异无统计学意义（P＞0.05）（见表2）。

表2 Omi/HtrA2在甲状腺乳头状癌组织中的表达与临床病理特征的关系

3 讨论

近年来，甲状腺癌患病率呈现逐年上升的趋势[6]，其发病机制非常复杂。细胞凋亡是通过体内外因素触发细胞内的死亡程序从而导致细胞主动死亡，在机体的胚胎发育、内环境稳态以及免疫防御等方面起着至关重要的作用，同时其调节紊乱与肿瘤发生、发展密切相关。Omi/HtrA2是一种高效的促凋亡因子，对多种肿瘤细胞及组织具有促凋亡作用[7-8]。Omi/HtrA2的发现是对线粒体调控细胞凋亡中心理论的完善和补充，它是一种线粒体丝氨酸蛋白酶，在生理条件下具有促进细胞存活的作用，然而在应激情况下，将成为一种促凋亡蛋白[9]。在凋亡信号的刺激下，Omi/HtrA2释放到胞浆，转化成具有促凋亡功能的成熟分子，进而通过依赖和非依赖半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（Caspase）途径促进细胞凋亡[10]。Caspase途径的进行是通过成熟形式Omi/HtrA2分子的N端与凋亡抑制蛋白家族（IAPs）的BIR（杆状病毒IAP的重复序列区）结构域相结合，从而解除IAPs对Caspase的抑制作用[11-12]。非依赖Caspase途径促进细胞凋亡的实现与Omi/HtrA2蛋白酶活力密切相关[13]。本实验研究，在甲状腺乳头状癌中的表达情况，并深入探讨参与甲状腺乳头状癌发生、发展及增殖恶变的分子生物学机制，有助于进一步全面明确甲状腺乳头状癌的恶性生物学行为及机制，为甲状腺乳头状癌患者的早期诊断、合理治疗以及预后判断找到新的靶点。

本研究运用免疫组织化学及Western-blot技术检测Omi/HtrA2蛋白在甲状腺乳头状癌组织、正常甲状腺组织及结节性甲状腺肿中的表达量，结果显示，该蛋白在甲状腺乳头状癌中的表达水平高于正常甲状腺组织和结节性甲状腺肿。这表明Omi/HtrA2蛋白可能参与甲状腺乳头状癌的发生、发展。恶性肿瘤在发生、发展过程中逐渐获得抵抗凋亡的能力，具有促凋亡功能的Omi/HtrA2过度表达未能阻止肿瘤的发展，其原因值得探究。研究表明，可能是由于Omi/HtrA2的表达量不足以触发细胞死亡。TRENCIA等[14]研究也证明，肿瘤细胞中过多表达的抗凋亡蛋白ped/pea15可以抑制由Omi/HtrA2引发的细胞凋亡。因此可以认为，由Omi/HtrA2介导的促细胞凋亡作用可能依赖于其本身的活性和其他抗凋亡蛋白的水平，如IAPs。另一种可能是，一部分Omi/HtrA2被隔离在线粒体中或者不被释放到细胞质中。LIU等[15]的研究表明，鸟核苷酸结合蛋白（RAS）通过抑制线粒体Omi/HtrA2蛋白酶释放到细胞质中来抑制细胞凋亡。因此，线粒体中的Omi/HtrA2被封存也可能是其未能抑制肿瘤发展、转移的原因。

笔者还进一步对Omi/HtrA2蛋白的表达与甲状腺乳头状癌各临床病理指标的关系进行分析，结果显示，Omi/HtrA2蛋白的阳性表达与甲状腺乳头状癌的包膜浸润、淋巴结转移、肿瘤临床分期及肿瘤分化有关。在无包膜浸润、无淋巴结转移、临床分期早和分化程度高的甲状腺乳头状癌组织中，Omi/HtrA2表达相对增多，提示Omi/HtrA2与甲状腺乳头状癌的进展密切相关，可能促进甲状腺乳头状癌细胞的凋亡，与肿瘤细胞的抗凋亡作用相抗衡。

综上所述，本研究结果提示，Omi/HtrA2可能是预测甲状腺乳头状癌恶性生物学行为的新标志，同时其基因也是抗肿瘤靶向治疗的一个新的突破点，研究针对其设计的新治疗靶点，可促进肿瘤细胞的凋亡，从而达到抑制癌细胞的生长、浸润与转移的目的，这可能对延缓肿瘤复发、提高患者的生存率有一定的帮助。

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（张蕾 编辑）

Expression of Omi/HtrA2 protein in papillary thyroid carcinoma and its significance

Ru-hua GUAN1,Hui FANG2,Gang XU2,Ying YANG2,Mei-liu YANG2,Cui-lin ZHANG1, Li ZHOU1,Yu-kai LI3,Lei ZHOU2,Ya-zhong ZHANG2,Jin-li TIAN2,Yue YANG2
(1.Department of Endocrinology,North China University of Technology,Tangshan,Hebei, 063000,P.R.China;2.Department of Endocrinology,the Worker's Hospital of Tangshan, Tangshan,Hebei,063000,P.R.China;3.Department of Endocrinology,Hebei Medical University,Shijiazhuang,Hebei,050000,P.R.China)

【Objective】To analyze the expression of mitochondrial serine protease(Omi/HtrA2)in papillary thyroid carcinoma and its correlation with clinicopathologic parameters.【Methods】Immunohistochemistry and Western blot were used to assess the expression of Omi/HtrA2 protein in 120 cases of papillary thyroid carcinoma,40 cases of nodular goiter and 40 cases of normal thyroid tissue,and its associations with clinicopathologic parameters were analyzed.【Results】Immunohistochemistry showed the expression of Omi/HtrA2 was positive in 71.67%of the papillary thyroid carcinoma tissue,which was significantly higher than that in the nodular goiter(30.00%)and nomal thyroid tissue(32.50%,P＜0.05).Western blot showed the relative amount of Omi/HtrA2 protein in the papillary thyroid carcinoma tissue was(1.184±0.060),which was significantly higher than that in the nodular goiter(0.559±0.096)and normal thyroid tissue[(0.606±0.097),P＜0.05].The expression of Omi/HtrA2 was correlated with extracapsular invasion,lymph node metastasis,clinical staging and tumor differentiation(P＜0.05).【Conclusion】The expression of Omi/HtrA2 protein may be amarker for judging the malignancy and prognosis of papillary thyroid carcinoma.

papillarythyroidcarcinoma；mitochondrialserineprotease；immunohistochemistry；Western blot

R736.1

A

1005-8982（2015）30-0028-05

2015-04-07

房辉，E-mail：fanghui@medmail.com.cn