二羟二丁基醚及其手性杂质的毛细管GC法分离

张玉霞，李　丹，林　洁，康天怿，陈芙蓉，宁　欣，徐小平

（四川大学华西药学院，四川 成都 610041）

二羟二丁基醚及其手性杂质的毛细管GC法分离

张玉霞，李丹，林洁，康天怿，陈芙蓉，宁欣，徐小平

（四川大学华西药学院，四川 成都 610041）

采用毛细管气相色谱法（CGC）分别对二羟二丁基醚（DHDB）及手性杂质的分离条件进行考察，建立二羟二丁基醚（DHDB）含量的测定方法。PEG-20M（30m×0.53mm×1.0μm）毛细管柱为色谱柱，FID为检测器，正辛醇作为内标，DHDB手性杂质程序升温条件为初温120℃，以0.5℃/min升温至180℃，保持40min；DHDB含量测定程序升温条件为140℃保持1min，以20℃/min升至200℃。DHDB及其手性异构体得到完全分离；DHDB在66.70～800.1μg/mL的范围具有良好的线性关系（y=0.0070x+0.0554；r2=0.9996）；平均回收率为99.54%，重复性RSD为0.68%，中间精密度RSD为0.95%，样品的平均含量为77.92%（RSD=0.25%）。该方法快速、简便，适于DHDB手性杂质分析和含量测定。

毛细管GC；二羟二丁基醚；手性杂质；含量测定

0　引　言

二羟二丁基醚（DHDB）属于胆汁分泌双相促进剂，具有利胆、消炎、解痉、护肝、降脂、排石、增加胆汁分泌的作用，可用于胆道结石及胆囊炎、胆管炎等多种慢性胆道感染的治疗，是一种高效的利胆剂、胆石溶解剂和保肝药[1-3]，因此倍受关注。然而，DHDB结构中的两个手性碳和潜在的多位取代杂质，使得DHDB及其杂质的检测尤为困难，迄今，国内外未见关于DHDB原料药及制剂质量的研究。根据相关文献报道，其常见的检测手段主要有气相色谱和气相色谱-质谱联用技术（GC-MS），如Serena等[4]以GC-MS分离鉴定了DHDB主成分及其杂质异构体；朱晓桐[5]采用GC法分离检测了DHDB；李志万[6]以手性GC法对DHDB原料药和杂质等手性组分进行了完全分离。本文针对二羟二丁基醚手性化合物具有几何异构杂质和光学异构杂质的特性，同时为了满足二羟二丁基醚含量测定中需要单峰检出的要求，分别筛选适合分离二羟二丁基醚手性异构杂质[7-8]和二羟二丁基醚含量测定的色谱条件，建立了二羟二丁基醚单峰含量测定方法[9-11]，为二羟二丁基醚及其制剂的进一步质量研究提供较好的分析方法。

1　实验部分

1.1仪器与试剂

1.1.1仪器

GC-7890气相色谱仪（上海天美公司）；XW-80A旋涡振荡器（江苏海门麒麟医用仪器厂）；BT-125D电子天平（Sartorius，德国）；PCF-10超纯水机（成都品成科技有限公司）。

1.1.2试剂

二羟二丁基醚和对照品（纯度：77.46%）（自制，四川大学华西药学院药物化学系提供）；正辛醇（色谱纯，天津市博迪化工有限公司）；十二烷（AR，成都市科龙化工试剂厂），水为自制超纯水。正戊醇（色谱纯）、丙酮（AR）均购自天津市科密欧化学试剂有限公司。

1.1.3溶液的配制

对照品溶液的制备：取二羟二丁基醚对照品250 mg，精密称定，置于100 mL量瓶中，精密加入内标储备液1mL，加丙酮至刻度，摇匀，作为对照品储备液。精密量取上述储备液1 mL于10 mL容量瓶中，加丙酮至刻度，摇匀得到含二羟二丁基醚250μg/mL溶液作为对照品溶液。

供试品溶液的制备：取样品250mg，精密称定，置于100 mL量瓶中，精密加入内标储备液1 mL，用丙酮定容至刻度，摇匀。精密量取1 mL置于10 mL容量瓶中，丙酮定容至刻度，制得250μg/mL二羟二丁基醚作为供试品溶液。

内标溶液的配制：精密量取正辛醇4.0mL（500mL/ 413.5），置于100mL量瓶中，用丙酮稀释至刻度，制成33.08mg/mL的内标溶液。

1.2色谱柱的筛选

以二羟二丁基醚主成分的柱效及峰的对称性和杂质2异构体的分离度等色谱参数为指标，分别考察了OV-624（30 m×0.53 mm×0.5 μm）、OV-17（30 m× 0.53 mm×1.0μm）、PEG-20M（30m×0.53mm×1.0μm）等色谱柱。其中，OV-624柱对主成分表现出较高的柱效，但峰有拖尾，且杂质2的手性异构体不能分离；OV-17柱的对主成分的柱效和对称性均较差，且杂质2手性异构体不能分离；PEG-20M柱主成分峰和异构体峰均表现出较好的柱效和分离度，杂质2的两个手性异构体能较好分离，分析时间较短，既能够满足二羟二丁基醚主成分的定量，也能够满足各杂质的有效分离，最终确定为本实验的色谱柱。

1.2.1程序升温对二羟二丁基醚及其手性杂质分离的影响

据二羟二丁基醚主成分异构体的结构特点，柱温分别选取了程序升温100℃→180℃，120℃→180℃和140℃→180℃进行研究，升温速率均为0.5℃/min。结果表明，从起始温度100℃升至180℃时，保留时间过长，且峰形不好；采用140℃升至180℃时，二羟二丁基醚主成分的手性异构体不能完全分开；从120℃升至180℃时，二羟二丁基醚主成分峰分离度以及峰形较好，故确定此条件为分离的柱温条件。

综合上述色谱柱的筛选结果，确定二羟二丁基醚和杂质手性异构体的色谱条件：以正辛醇作内标物，毛细管色谱柱PEG-20M（30m×0.53mm×1.0μm），程序升温为120℃起始，升温速率0.5℃/min升至180℃，保持40 min。进样温度为250℃；检测器（FID）温度为250℃，流量：3mL/min，分流比98∶2。如图1（a）所示。

1.2.2程序升温对二羟二丁基醚定量的影响

为避免二羟二丁基醚主成分手性成分的裂分，分别选取了140℃、180℃等温条件和程序升温120℃→180℃、140℃→180℃、140℃→200℃、40℃→220℃，共6个温度进行研究，结果表明，程序升温140℃→200℃时，即140℃初始，保持1 min后，以20℃/min的速度升至200℃，二羟二丁基醚主成分峰的柱效、对称性和分离度均较其他几个温度下的结果更好。

故确定PEG-20M毛细管柱（30 m×0.53 mm× 1.0 μm）；检测器（FID）温度：250℃；进样口温度：250℃；程序升温：初始温度为140℃，保持1min后，以20℃/min的速度升至200℃；载气（N2）：3mL/min；氢气：50mL/min；空气：50mL/min；尾吹（N2）：50mL/min为二羟二丁基醚定量的色谱条件，如图1（b）所示。

图1　二羟二丁基醚定量色谱图和手性杂质色谱图

1.2.3内标

据二羟二丁基醚的沸点及其化学性质，分别对比了十二烷、正辛醇、正戊醇与二羟二丁基醚的分离情况。结果表明，正辛醇与二羟二丁基醚出峰时间接近，并且能完全分离，因此选定正辛醇为内标。

1.3二羟二丁基醚中手性杂质的检测

1.3.1精密度和重复性考察

精密量取1μL供试品溶液注入气相色谱仪，连续进样6次，记录二羟二丁基醚的色谱图，精密度良好。6次样品峰高的相对标准偏差分别为0.53%和0.38%。

制备6份供试品溶液，分别精密量取1μL中等浓度供试品溶液即含二羟二丁基醚约250μg/mL的供试品溶液反复测定，记录二羟二丁基醚色谱图，6份样品峰高的相对标准偏差分别为1.25%和1.15%，重复性高。

1.3.2面积归一化法定量手性杂质

分别精密量取3批小试样品各适量，按照“1.1.3”项下供试品溶液配制，精密量取各供试品溶液1 μL注入气相色谱仪，记录色谱图，经面积归一化法计算3批二羟二丁基醚手性杂质1和杂质2的平均含量，分别为12.78%和9.67%。

1.4二羟二丁基醚的含量测定

目前，二羟二丁基醚含量的测定主要有两种方法：1）将其主成分分开测定其含量；2）测量其主成分异构体总的含量。为了遵循该药品的进口药标准，采用的后一种测定方法。

1.4.1方法学考察

1）标准曲线及检出限。精密称量二羟二丁基醚对照品266.7 mg于100mL容量瓶，加入1mL内标储备溶液，用丙酮定容至刻度，摇匀，得2.667mg/mL对照品储备液；分别精密量取该储备溶液适量置于10mL容量瓶中，用丙酮定容至刻度，摇匀，制成含二羟二丁基醚66.7，133.4，266.7，533.4，800.1μg/mL的线性验证溶液。精密量取1μL注入气相色谱仪，记录色谱图。结果表明，二羟二丁基醚在66.7～800.1μg/mL之间有良好的线性关系，如图2所示；取线性研究中对照品溶液（125 μg/mL）逐级稀释，测得二羟二丁基醚检出限和定量限分别为0.025ng（S/N≥3）和0.125ng（S/N≥10）。

图2　二羟二丁基醚标准曲线图

2）精密度与重复性的考察。精密量取1μL供试品溶液注入气相色谱仪，连续进样6次，记录二羟二丁基醚的色谱图，6次样品峰高与内标峰高比值的相对标准偏差为0.36%，精密度良好。经考查中间精密度的相对标准偏差为0.95%，说明中间精密度良好。

制备6份供试品溶液，分别精密量取1μL中等浓度供试品溶液即含二羟二丁基醚约250μg/mL的供试品溶液反复测定，记录二羟二丁基醚色谱图，6份样品峰高与内标峰高比值的相对标准偏差为0.68%，重复性好。

3）加样回收率。分别精密量取对照品储备液（2.5mg/mL）适量，于3个10mL容量瓶，丙酮溶解并稀释至刻度，制成高、中、低（含二羟二丁基醚300，250，200μg/mL）3个不同浓度的对照品溶液。取250μg/mL供试品溶液各1mL于9只离心管，分别精密加入高、中、低对照品溶液1mL（即每个浓度制3份）。精密量取1μL注入气相色谱仪中，记录色谱图。结果表明，样品平均回收率为99.54%，回收率RSD为1.16%，说明本方法准确度满足实验要求。

1.4.2DHDB的含量测定

分别精密量取样品适量，按照“1.1.3”项下供试品溶液配制，精密量取各供试品溶液1μL注入气相色谱仪，记录色谱图，由二羟二丁基醚的色谱峰高与内标峰高的比值，经内标法计算二羟二丁基醚的百分含量。6批二羟二丁基醚的含量测定（A供试品/A对照品× C对照品×100%）结果见表1，总平均含量为77.92%，符合二羟二丁基醚进口标准含量大于50%的要求。

表1　6批DHDB原料药含量测定结果（n=4）

2　讨　论

根据二羟二丁基醚的结构特点和文献表明，分离二羟二丁基醚及其杂质常见的色谱柱有PEG-20M柱和OV-624柱。其中PEG-20M柱是目前二羟二丁基醚药典标准的规定柱，而且PEG-20M柱适合分离极性较强的醇、酚、醚类化合物。所以，本文重点采用了PEG-20M的毛细管柱作为实验柱。

二羟二丁基醚为手性化合物，根据药品仿制标准的要求，需要对二羟二丁基醚进行单峰定量检测，从而避免了目前二羟二丁基醚手性异构体对照品难以获得的问题，确保二羟二丁基醚主成分快速有效定量。本文选择了初始柱温为140℃，以20℃/min的速率升温到200℃时，二羟二丁基醚与几何异构体得到了完全分离，为二羟二丁基醚的含量测定提供基本条件。

另一方面，针对杂质的分离，实验需要在完全分离几何异构体杂质的基础上同时分离各几何杂质包含的手性异构杂质。为此，本文在降低初始柱温至120℃的基础上,采用较低的升温速率（0.5℃/min）升温至180℃，并保持40min的程序，使二羟二丁基醚及其两个几何异构杂质中的手性异构体均被完全分离，为二羟二丁基醚中手性杂质的检查提供基础条件。

由于二羟二丁基醚的分子结构中存在两个手性中心，即理论上应有4个手性异构体，3个组份应有10个手性异构体。然而，即便是最新的手性色谱柱也仅能检测8个手性组份峰。而采用PEG-20M柱检出了6个手性异构体峰。分析原因可能与合成工艺相关，或个别手性异构体含量过低未能被直接检出。

3　结束语

本文采用PEG-20M的毛细管柱的程序升温GC法，所建立的分离手性异构的条件和分离二羟二丁基醚单峰用于含量测定色谱条件，具有简便、快速、准确的特点，能够满足二羟二丁基醚的质量研究。是二羟二丁基醚手性杂质分析和二羟二丁基醚含量测定的较好方法。

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CGC separation of DHDB and chiral impurities

ZHANG Yuxia，LI Dan，LIN Jie，KANG Tianyi，CHEN Furong，NING Xin，XU Xiaoping
（School of Pharmacy，Sichuan University，Chengdu 610041，China）

Capillary Gas Chromatography（CGC）has been adopted to determine the content of dihydroxydibutylether（DHDB） basedontheseparationconditionsofDHDBanditschiral impurities.Chromatographic column：PEG-20M capillary column（30 m×0.53 mm×1.0 μm）；detector: flame ionization detector（FID）；internal standard（IS）：n-Octano.The separation conditions of DHDB and its chiral impurities are as follows：The column temperature was programmed from 120℃ to 180℃ at the rate of 0.5℃/min and then stayed there for 40 min.The assaying conditions of DHDBareasfollows：Thecolumntemperaturestayedat140℃foroneminuteandthen programmed to 200℃at the rate of 20℃/min.DHDB and its chiral impurities have been completely separated.The liner relationship of DHDB is good within the range of 66.70 μg/mL to 800.1 μg/mL（y=0.007 0x+0.055 4；r2=0.999 6）.Theaveragerecovery，repeatabilityRSD，intermediate precision RSD and mean content are 99.54%，0.68%，0.95%and 77.92% （RSD=0.25%）respectively.The two chromatographic conditions established are suitable for separating DHDB from its chiral impurities and determining the content of DHDB.It is convenient，fast and practical.

CGC；dihydroxydibutylether；chiral impurities；content detecting

A

1674-5124（2015）12-0041-04

10.11857/j.issn.1674-5124.2015.12.011

2015-03-20；

2015-05-07

张玉霞（1990-），女，四川绵阳市人，硕士研究生，专业方向为药物质量控制与药物代谢分析。

徐小平（1962-），男，四川宜宾市人，副教授，硕士，主要从事药品质量控制研究。