苹果着色与冷藏期间多酚及相关酶活性的关系

白 鸽，郭玉蓉*，陈 磊，张晓瑞

（陕西师范大学食品工程与营养科学学院，陕西 西安 710119）

苹果着色与冷藏期间多酚及相关酶活性的关系

白 鸽，郭玉蓉*，陈 磊，张晓瑞

（陕西师范大学食品工程与营养科学学院，陕西 西安 710119）

利用红色面积不小于80%和红色面积大不于20%的‘富士’苹果为材料，分析2种样品在冷藏期间品质、多酚及相关酶活性的变化，测定冷库贮藏期间苹果的理化指标、总酚含量及其苯丙氨酸解氨酶（PAL）、多酚氧化酶（PPO）、过氧化物酶（POD）活性变化，并用高效液相色谱检测苹果多酚组成成分变化。结果发现，果实贮藏过程中硬度持续下降，可溶性固形物含量和pH值持续升高；总多酚含量变化趋势为下降-升高-下降，多数单体酚含量变化与总多酚含量变化一致，且二者含量均在贮藏第100天时达到峰值；PAL活性在贮藏第100天时出现峰值，而PPO活性峰值则出现在贮藏第50天时，POD活性在贮藏第150天时出现峰值，3 种酶活性的变化与多酚含量变化是密切相关的。结果表明，‘富士’苹果进行冷库贮藏，贮藏第100天左右时营养价值最高，达到最佳食用时期。

苹果；冷库贮藏；理化指标；酶活性；多酚

苹果是世界四大水果之一，深受消费者的喜爱[1]，在世界果品市场占有重要地位[2]。苹果种植过程中由于田间管理不同，造成苹果着色出现很大差异，进而影响苹果贮藏品质和多酚含量。苹果中富含的多酚类物质，包括种类繁多的酚酸类和类黄酮类[3-4]，对人体保持健康具有重要的作用。大量的研究[5-8]显示苹果多酚具有多种药理功能如抗癌、抗氧化、抗动脉硬化、保护软骨与增强骨质、生发与乌发、保护视网膜、抗视力退化、抗菌、抗病毒、抗过敏、防龋齿、防辐射、防治冠心病与中风等心脑血管疾病，其许多生理功能活性比茶多酚要高100 倍以上[9]。由于我国在苹果种植方面以晚熟的‘富士’系为主，渐渐地决定了国内苹果消费以‘富士’为主，并间接 导致我国苹果市场“早熟奇缺，中熟不足，晚熟过剩”的产品结构[10-11]。果实采后多酚的含量变化除了受内部相关酶活性、成熟度、色泽的影响外，还受外部因素影响，如低温、1-甲基环丙烯（1-methylcyclopropene，1-MCP）、CO2体积分数[12]等。因此，对晚熟‘富士’苹果进行贮藏，以持续供应市场，且市场贮藏前半期以冷库贮藏为主，后半期的市场供应则以气调库苹果为主。

本实验以宜川晚熟‘富士’苹果为实验材料，研究其在采后冷藏期间多酚及其相关酶活性的变化，并分析各项检测指标之间的相关性，旨在了解苹果在贮藏过程中果实品质变化规律、多酚和酶活性的变化特点，以期弥补前人未将酶活性与多酚单体含量变化共同分析的空白，并为‘富士’苹果的贮藏、保鲜、销售和食用提供理论参考和依据。

1 材料与方法

1.1 材料及预处理

实验于2013—2014年在陕西华圣果业有限公司贮藏室和陕西师范大学食品学院实验室进行，试材选定陕西省宜川县，一个管理良好的农家果园的‘富士’苹果，并按照苹果果皮着色程度将其分成2组：红色面积不小于80%记为颜色好的苹果；红色面积不大于20%记为颜色差的苹果，放入华圣果业的冷库进行贮藏（±0.5 ℃），贮藏期间完全按照华圣果业贮藏条件进行管理。每 50 d取1 次样，共取5 次样，每次每组20 个果实，取出后立即用冰壶带回实验室，其中10 个‘富士’果实进行理化指标测定，剩下10 个果实皮（厚度约0.5 mm）、肉分开后，分别放入—80 ℃冰箱贮藏，用以后续实验。

1.2 试剂与仪器

甲醇（色谱纯） 美国Fisher Scientific公司；绿原酸、表儿茶素、金丝桃苷、芦丁、根皮苷、槲皮苷标准品（色谱纯） 美国Sigma公司。

FT-327硬度计 意大利 Breuzzi公司；B225581糖度计 日本Atago公司；雷磁PHS-3CpH计 上海精密科学仪器有限公司；Multiskan Go全波长酶标仪 美国Thermo公司；TGL-16G高速低温离心机 上海安亭公司；超声波仪器 昆山市超声仪器有限公司；电子天平 北京赛多利斯仪器系统有限公司；超高效液相色谱液相分析系统 美国Dionex公司；高效液相色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 ☒m） 美国Dikma公司。

1.3 方法

1.3.1 苹果理化指标的测定[2]

果实硬度测定：在每个苹果肩部均匀选择3 个位置，用FT-327硬度计测定（11 mm），取平均值；可溶性固形物含量和pH值测定：八分法取苹果果肉榨汁，用糖度计测定可溶性固形物含量；用pH计测定pH值。

1.3.2 总多酚含量及组成测定

1.3.2.1 总多酚含量测定

果皮多酚测定参照孙建霞[13]的方法稍加改动。用液氮分别研磨样品，按料液比1∶4（g/mL）加入65%乙醇溶液58 ℃水浴35 min，将提取液在4 ℃、12 000 r/min离心10 min取上清液。取1.0 mL上清液加入12 mL饱和Na2CO3和1.0 mL福林酚溶液，定容至25 mL。室温避光反应1 h后，检测OD765nm值。

总酚含量测定标准曲线的绘制：用5 mL 70%乙醇溶液溶解0.25 g没食子酸，定容至50 mL，分别移取0.5、1.0、1.5、2.5、5.0 mL至容量瓶中，用去离子水定容50 mL，制备质量浓度分别为50、100、150、250、500 mg/L的没食子酸溶液。从上述不同质量浓度的标准溶液中分别移取0.5 mL加入到50 mL容量瓶中后分别加入30 mL去离子水，混匀，加入2.5 mL Folin-Ciocalteu试剂，混匀后，加入7.5 mL 20%碳酸钠溶液，混合，定容。室温避光反应1 h后，检测OD765nm值，从而得到标准曲线。将测得的OD765nm值代入所得标准曲线，即可换算出总多酚的没食子酸当量值。

1.3.2.2 多酚组成测定

果皮用液氮研磨成粉末，按照料液比1∶4（g/mL）加入65%乙醇溶液，58 ℃水浴浸提35 min。将提取液在4 ℃、12 000 r/min离心10 min，上清液经0.45 ☒m的滤膜过滤后，取400 μL转移至进样瓶中等待进样。Dionex UPLC液相分析系统和Dikma HPLC柱（250 mm×4.6 mm，5 ☒m）；溶液A（甲醇）和溶液B（3‰三氟乙酸）。利用溶液B进行梯度洗脱：0～10 min，80% B；12～20 min，78% B；22～40 min，68% B；42～50 min，60% B；52～70 min，55% B；72 min，50% B；80 min，45% B；88～95 min，80% B。柱温30 ℃；流动相速率：1.0 mL/min；进样量20 μL。在280 nm波长进行多酚组成的检测，记录出峰时间，和绿原酸、表儿茶素、金丝桃苷、芦丁、根皮苷、槲皮苷6 种多酚单体标品进行比对鉴定多酚的成分。同时，在得到液相图谱之后，以对应峰面积的积分值来表示相应多酚单体的含量。

1.3.3 苯丙氨酸解氨酶（phenylalnine ammonialyase，PAL）活性测定

参照林植芳等[14]的方法。每次用蒸馏水洗净实验果，用滤纸吸干表面水分，粉碎后取0.50 g果肉，加入5 mL 0.05 mol/L pH 8.8的硼酸缓冲液（内含0.005 mol/L β-巯基乙醇），然后加入0.10 g聚乙烯吡咯烷酮和少许石英砂，冰浴条件下研磨成匀浆，4 ℃、12 000 r/min离心20 min，上清液为酶液，测定PAL活性。

酶活性测定反应体系：0.02 mol/L L-苯丙氨酸（用0.1 mol/L、pH 8.8的硼酸缓冲液配制）1.0 mL，0.05 mol/L硼酸缓冲液2.0 mL，1.0 mL酶液，30 ℃水浴30 min，在290 nm处测定OD290nm值。每克鲜质量每分钟所引起光密度值变化 0.0l为一个酶活力单位。

1.3.4 多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）和过氧化物酶（peroxidase，POD）活性测定

酶液的制备：取3.0 g 果肉样品，加2 mL 100 mmol/L pH 5.5的醋酸缓冲溶液，冰浴研磨匀浆，在4 ℃、14 000 r/min离心30 min，取上清液作为酶液，测定PPO活性[15-16]。

PPO活性检测：反应体系为2 mL 50 mmol/L pH值为5.5的醋酸缓冲溶液、0.6 mL 1 mol/L 邻苯二酚溶液、0.2 mL 酶液；从加入酶液1 min开始，记录每分钟反应体系在420 nm 波长的光密度值，连续测定2 min。以每分钟内反应体系在420 nm波长处的光密度值ΔOD420nm为一个酶活单位U。

POD活性检测：反应体系为2.6 mL 25 mmol/L的愈创木酚溶液、0.2 mL 250 mmol/L 过氧化氢溶液、0.4 mL 酶液；从加入酶液1 min开始，记录每分钟反应体系在470 nm 波长的光密度值，连续测定2 min。以每分钟内反应体系在470 nm波长处的ΔOD470nm为一个酶活单位U。

1.4 数据分析

以上所有实验数据均重复3 次以上，使用SPSS 18.0数理统计分析软件进行显著性分析（Duncan分析，P＜0.05）。

2 结果与分析

2.1 2种着色苹果冷藏贮藏期间品质及pH值变化

表1 苹果贮藏期间品质变化理化指标的变化Table1 Changes in physicochemical characteristics of apple during different storage perriiooddss

由表1可知，同一贮藏时期，颜色好的苹果的硬度均小于颜色差的苹果，但可溶性固形物含量却显著高于颜色差的苹果（P＜0.05）。pH值方面，颜色好的苹果只略大于颜色差的苹果。对于硬度的变化，无论是颜色好还是颜色差的苹果，随着贮藏时间的延长，硬度均呈现下降趋势，这与王少敏[17]、李宏建[18]等的研究结果相一致。2种样品硬度下降速率在贮藏100～150 d时达到最大，贮藏达第200天时，果实的硬度仅为鲜果的66.6%，硬度的减小反映果实的衰老程度，这说明冷库贮藏100 d之后，果实开始迅速衰老，不宜继续贮藏，即贮藏100 d之后的苹果食用价值显著降低。颜色好和颜色差的苹果随着贮藏时间的延长，可溶性固形物含量均呈现升高的变化趋势，不同采收期[19-22]、贮藏条件、果实品种及果实自身成熟度等条件均会影响苹果的贮藏品质。苹果贮藏期间，果实衰老，淀粉等糖类物质水解导致细胞膜通透性发生变化，细胞内物质外泄从而引起可溶性固形物含量的升高。随着贮藏时间的延长，pH值也呈现升高的变化趋势，升高速率同样在贮藏100～150 d时达到最大，当苹果中的可滴定酸含量下降时，果实的酸度下降，即本实验得到的贮藏过程中pH值持续升高的结果，这一现象与已报道[17-19]研究实验结果相符。

2.2 2种着色苹果冷藏期间多酚含量变化

2.2.1 总多酚含量的变化

图1 贮藏期间苹果总多酚含量的变化Fig.1 Changes in total polyphenols content of apple during different storage periods

2种着色苹果贮藏期间多酚变化如图1所示，2种着色苹果总多酚含量均在贮藏第200天时降到最低；在贮藏第100天时达到最高，颜色好和颜色差的果皮总多酚含量分别为贮藏第200天时的3.28 倍和3.82 倍，仅稍高于鲜果。在贮藏的各个时期，颜色好的苹果总多酚含量均高于颜色差的苹果，而两者总酚的变化趋势是相同的，均为先降低（苹果在贮藏期间呼吸作用的自然消耗），再升高（由于苹果处于低温环境而做出的适应性变化，以抵抗不良环境对其呼吸的影响），再下降（苹果在适应环境之后的自然衰老所致）。

2.2.2 多酚单体含量的变化

表2 贮藏期间苹果中多酚单体含量变化Table2 Changes in mono-phenol contents during cold storage of apple %

如表2所示，富士苹果多酚中主要有绿原酸、表儿茶素、金丝桃苷、芦丁、根皮苷、槲皮苷6 种成分。贮藏过程中，颜色好的苹果中槲皮苷的变化趋势为先升高后降低，其余5 种多酚单体变化均为：降低-升高-降低，这与其总酚含量变化相符合；颜色差的苹果中6 种多酚单体变化均为：降低-升高-降低，也与总酚含量变化相一致。对比颜色好和颜色差苹果的多酚单体结果，发现颜色好的苹果各单体酚在贮藏第200天时与鲜果相差不显著（P＜0.05）；颜色差的苹果，表儿茶素、异槲皮苷、芦丁、根皮苷、槲皮素5 种单体酚含量变化都很大，其鲜果中的含量分别为贮藏第200天时含量的2.54、6.61、2.97、5.10、4.94 倍。另外，表2显示贮藏第50天时颜色好的苹果中金丝桃苷未检出，这是由于其含量过低，低于了高效液相色谱的检出下限所致。

对比鲜果和贮藏第200天时的苹果发现，其总多酚和各单体酚含量下降显著。且在贮藏100 d后，总多酚下降速率显著增大，即：总多酚在冷库贮藏前3 个月内保存较好[23]。此外，在贮藏前100 d，苹果中总多酚含量及各单体酚含量呈先下降后上升趋势，在第100天时含量达到峰值，此时苹果的抗性增强，营养价值最好，是理想的食用时期。

2.3 PAL活性变化

图2 贮藏期间苹果中PAL活性变化Fig.2 Changes in PAL activity during cold storage of apple

如图2所示，PAL活性在贮藏初期变化较为平缓，在贮藏第100天时酶活性达到峰值，而后下降；颜色差的苹果酶活性变化较颜色好的更为显著（P＜0.05），且其酶活性始终大于颜色好的苹果，在峰值处即贮藏第100天时PAL活性是颜色好苹果的1.70 倍，是颜色差鲜果的1.75 倍。PAL与多酚的合成有关，当贮藏第100天酶活性达到最大时，图1中总多酚含量在贮藏第100天时也有一次回升，之后同时下降，二者的变化趋势是相符合的。

2.4 PPO、POD活性变化

如图3所示，颜色差苹果的PPO活性在贮藏第50天时达到峰值，而后下降并在贮藏第100天开始趋于平缓，这与张文英等[24]的研究结果也是一致的。颜色差苹果的PPO活性较颜色好的苹果变化仍旧显著，且其酶活性始终大于颜色好的苹果，在峰值处即贮藏第50天时PPO活性是颜色好苹果的2.31 倍，是颜色差鲜果的1.99 倍。而颜色好的苹果酶活性则呈下降趋势，并在贮藏第50～100天时达最大下降速率。由于颜色好苹果PPO活性小于颜色差苹果，因而颜色好苹果的总多酚含量在贮藏期间始终高于颜色差苹果的总多酚含量，这与图1中所得的总多酚含量结果一致。

图3 贮藏期间苹果中PPO活性变化Fig.3 Changes in PPO activity during cold storage of apple

图4 贮藏期间苹果中POD活性变化Fig.4 Changes in POD activity during cold storage of apple

如图4所示，POD活性在贮藏初期变化为缓慢下降，在贮藏第150天时酶活性达到峰值，而后下降，颜色差的苹果酶活性变化较颜色好的要剧烈，且其酶活性同样始终大于颜色好的苹果，在峰值处即贮藏第150天时POD活性是颜色好苹果的2.29 倍，是颜色差鲜果的1.79 倍。由于POD和PPO都与多酚的分解有关，颜色好苹果POD活性也小于颜色差苹果，因而颜色好苹果的总多酚含量在贮藏期间始终高于颜色差苹果的总多酚含量，这与图1中所得的总多酚含量结果是一致的。POD活性在贮藏后期突然增强并出现峰值，这可能是果实衰老的表现[25-26]。2.5 相关性分析结果

表3 相关性分析Table3 Correlation analysislysis

由表3可以看出，总多酚含量与各多酚单体含量显著正相关，即总酚含量高时，多酚单体含量也高；PAL活性与多酚单体含量显著正相关，尤其与绿原酸含量极显著正相关，即PAL活性越高，多酚单体含量越高；而PPO和POD活性与多酚单体含量呈现负相关，部分为显著负相关，PPO活性甚至与槲皮苷含量为极显著负相关，即PPO和POD活性越高，多酚单体含量就越低。相关性分析得到的结果再一次验证了以上各图、表呈现的实验结果，因而可以认定实验结果的真实性与实验结论的可靠性。

3 结 论

本实验研究发现：晚熟‘富士’苹果在贮藏期间可溶性固形物含量和pH值持续上升；贮藏100 d后，硬度开始迅速下降；总多酚含量和各多酚单体含量均在贮藏第100天时达到峰值；PAL、PPO、POD的活性变化与总多酚及多酚单体含量变化显著相关。

我国的苹果消费一直以鲜食苹果为主。晚熟‘富士’苹果10月中旬入冷库贮藏，从11月开始冷库贮藏的大量‘富士’苹果开始供应市场，持续至第2年1月底、2月初，此时苹果贮藏了100 d左右，时间约为春节前后，正值苹果消费高峰期。通过进行本实验，并将实验结果与前人的研究成果进行对比总结，得到苹果仅适宜于这一时间段的冷库贮藏，超过这个时间段，苹果会迅速衰老，各项品质指标和多酚含量均开始显著下降，苹果最终变得不适合食用。而在贮藏第100天左右时的苹果从营养价值上来说是最具有食用价值的。此时正值国内苹果消费的高峰期，这既迎合了消费需求，又使苹果的营养最大化被消费者利用。

[1] 江道伟. 不同产地红富士苹果果实和叶片糖积累及其相关酶活性变化研究[D]. 杨凌: 西北农林科技大学′2011.

[2] 唐海波. ‘红香脆’与‘新世界’苹果贮藏期间相关生理指标变化的研究[D]. 杨凌: 西北农林科技大学′2008.

[3] 冉军舰. 苹果多酚的组分鉴定及功能特性研究[D]. 杨凌: 西北农林科技大学′2013.

[4] 钱志伟′王育红′袁桂英′等. 苹果多酚抑制油脂氧化和抑菌性的特性研究[J]. 保鲜与加工′2009(4): 19-21.

[5] LU Yingrong FOO L Y Identification and quantification of major polyphenol in apple pomace[J]. Food Chemistry′1997′59: 187-194.

[6] LOTITO S B FREI B Relevnaee of apple polyphenols as antioxidants in human plasma contrasting in vitro and in vivo effects[J]. Free Rdaieal Bioloyg and Medieine′2004′36(2): 201-211.

[7] 戚向阳′陈福生′陈维军′等. 苹果多酚抑菌作用的研究[J]. 食品科学′2003′24(5): 33-36.

[8] SNADOVAL M OKUHAMA N N ANGELES F M et al Antioxidant activity of the cruiferous vegetbale Maea (Lepidium meyenii)[J]. Food Chemistry′2002′79(2): 207-213.

[9] 唐传核′彭志英. 苹果多酚的开发及应用[J]. 中国食品添加剂′2001(2): 41-45.

[10] 白沙沙. 鲜食苹果品质评价研究[D]. 北京: 中国农业科学院′2012.

[11] 石建平′霍学喜′聂鹏. 中国苹果消费现状及特征分析[J]. 北方园艺′2010(22): 184-185.

[12] 李喜宏′张培培′李伟丽′等. 高CO2对冷藏富士苹果货架期品质的影响[J]. 食品科技′2010′35(4): 54-58.

[13] 孙建霞. 苹果多酚的提取分离及其主要功能活性研究[D]. 泰安: 山东农业大学′2005.

[14] 林植芳′李双顺′张东林′等. 采摘后荔枝果皮色素、总酚及有关酶活性的变化[J]. 植物学报′1988′30(1): 40-45.

[15] 汤凤霞′魏好程′曹禹. 芒果多酚氧化酶的特性及抑制研究[J]. 食品科学′2006′27(12): 156-160.

[16] 柳素洁. 香蕉多酚氧化酶性质及在果酒发酵中褐变控制的研究[D]. 泰安: 山东农业大学′2012.

[17] 王少敏′沈广宁′薛培生. 1-MCP与套袋对红富士苹果贮藏生理和品质的影响[J]. 山东农业科学′2009(10): 43-45.

[18] 李宏建′徐贵轩′宋哲′等. 岳帅苹果贮藏期间果实软化生理变化研究[J]. 江苏农业科学′2011(1): 315-317.

[19] 牛锐敏′饶景萍′韩新花′等. 不同采收期对红富士苹果贮藏品质的影响[J]. 西北农业学报′2006′15(3): 171-174.

[20] 陈彦同. 红富士苹果适时采收期初探[J]. 河北林业科技′2006(4): 17-18.

[21] CURRY E A Effect of harvest date and oxygen level on storability of late season apple cultivars[J]. Controled Atmosphere Research Conference′1989′1: 103-110.

[22] LUTON O L Harvest indices for british Columbla-grown apples[J]. Controled Atmosphere Research Conference′1989′1: 115-120.

[23] 黄利华′张业辉′赵力超′等. 贮藏条件对苹果多酚成分及抗氧化活性的影响[J]. 现代食品科技′2009′25(3): 252-255.

[24] 张文英′李扬. 贮藏方式对金红苹果贮藏品质影响的研究[J]. 北方园艺′2009(9): 208-210.

[25] 魏树伟′王少敏′王宏伟′等. 套袋红富士苹果贮藏过程中硬度及相关酶的变化[J]. 山东农业科学′2009(12): 55-59.

[26] 马慧. 套袋对嘎拉苹果贮藏期生理生化特性影响的研究[D]. 杨凌: 西北农林科技大学′2007.

Relationship of Coloration with Polyphenols and Related Enzyme Activities during Low-Temperature Storage of Apple

BAI Ge GUO Yurong*′CHEN Lei ZHANG Xiaorui
(College of Food Engineering and Nutritional Science Shaanxi Normal University Xi’an 710119′China)

The color of apple has a direct impact on its quality and storability We used apples with a percentage of red color area no less than 80% or no more than 20% to analyze their quality parameters polyphenols and related enzyme activities during low-temperature storage The quantitative analysis of polyphenols was performed by HPLC The physicochemical analyses showed that a constant decrease in fruit firmness was observed whereas soluble solids content and pH increased continuously during storage The changes in total polyphenol and mono-phenol contents consistently followed a decreaseincrease-decrease trend and reached peaks after 100 days of storage Concurrently the activity of phenylalnine ammonialyase (PAL attained a peak However the activities of polyphenol oxidase (PPO and peroxidase (POD reached their peaks after 50 and 150 days of storage respectively All of the three enzyme activities were closely related with polyphenols content in apple All of the above results demonstrate that apple has the maximum nutritional value when the storage period is 100 days.

apple low-temperature storage physicochemical indicators enzyme activity polyphenols

S661.1

A

1002-6630（2015）06-0246-05

10.7506/spkx1002-6630-201506047

2014-07-19

农业部现代苹果产业技术体系建设专项（CARS-28）

白鸽（1992—），女，硕士研究生，主要从事食品功能成分开发利用研究。E-mail：baige132196@163.com

*通信作者：郭玉蓉（1962—），女，教授，博士，主要从事食品生物加工研究。E-mail：guoyurong730@163.com