响应面法优化半纤维素酶提取梨渣中可溶性膳食纤维工艺

陈小举，吴学凤，姜绍通，李兴江′*

（1.巢湖学院化学化工与生命科学学院，安徽 巢湖 238000；2.合肥工业大学生物与食品工程学院，安徽 合肥 230009）

响应面法优化半纤维素酶提取梨渣中可溶性膳食纤维工艺

陈小举1′2，吴学凤2，姜绍通2，李兴江2′*

（1.巢湖学院化学化工与生命科学学院，安徽 巢湖 238000；2.合肥工业大学生物与食品工程学院，安徽 合肥 230009）

以砀山梨渣为原料，采用半纤维素酶水解法从梨渣中提取可溶性膳食纤维，并利用响应面法优化其提取条件。通过单因素试验考察液料比、酶添加量、酶解温度和酶解时间对可溶性膳食纤维提取率的影响。在单因素试验基础上，采用响应面法，利用Box-Behnken试验设计，对酶解工艺中各影响因素进行优化。结果表明，半纤维素酶水解法提取梨渣可溶性膳食纤维的最适提取工艺条件为：液料比13∶1（mL/g）、酶解温度58 ℃、酶解时间5 h、酶添加量35 U/g。在该条件下可溶性膳食纤维的提取率为15.21%，与理论值相差1.1%，表明实测值与理论值之间具有良好的拟合度。梨渣可作为一种优质膳食纤维的原料，半纤维素酶能有效用于梨渣中膳食纤维的提取。

梨渣；可溶性膳食纤维；半纤维素酶

砀山梨是我国果品中的名产，年产量40万 t左右。砀山梨深加工产品以浓缩果汁、果汁饮料为主，由于梨渣约占果实质量的40%～50%，因此，梨汁生产过程中会产生大量的梨渣。梨渣中含有石细胞[1]，直接用作饲料适口性较差，一般常常作为废料遭到弃丢，造成资源浪费。如果能将梨渣进行开发利用，不仅能增加企业的效益，还会减少梨渣堆积对环境造成的污染。

膳食纤维作为一种功能性食品基料日益受到人们的关注。尽管膳食纤维不能为人体提供任何营养，但对人体具有重要的生理功能。根据膳食纤维溶解性的不同，将其分为可溶性膳食纤维（soluble dietary fiber，SDF）和不溶性膳食纤维（insoluble dietary fiber，IDF）两大类。与IDF相比，SDF表现出更强的生理的功能，具有预防心血管疾病[2-3]、预防肥胖症[4]、预防糖尿病[5]、预防癌症[6-7]、抗氧化[8]、清除自由基[9]等生理效应。鉴于此，膳食纤维已被广泛的应用于食品中[10-13]。

随着对膳食纤维生理功能认识的不断加深，如何制备膳食纤维也成为了研究的热点。目前，SDF主要从植物中提取，其所用到的方法主要有：水提取法[14]、化学法[15]、物理法[16]、微生物发酵法[17]和酶法[18]等。与其他方法相比，酶法具有条件温和、操作简单、提取率高、产品纯度高等优点。半纤维素酶可促进纤维素、半纤维素分解，引起植物细胞壁溶解，使更多的植物细胞内溶物释放出来，并能将不易消化的大分子多糖、蛋白质和脂类降解成小分子物质，可提高水溶性膳食纤维的含量和品质[19]。砀山梨中含有大量的膳食纤维，但酶法提取梨渣中膳食纤维的研究报道较少，尤其是利用半纤维素酶提取梨渣中膳食纤维的研究尚未见报道。

本研究以榨汁后的砀山梨渣为原料，利用半纤维素酶水解法从梨渣中提取SDF，通过优化工艺条件，提高SDF提取率，以期提高砀山梨的综合利用率，减少环境污染，为丰富膳食纤维的材料来源及砀山梨的综合开发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

梨渣为砀山梨加工下脚料梨皮，梨核及梨渣经过烘干、粉碎过筛后得到的梨渣粉；半纤维素酶（食品级，酶活力为150 000 U/g） 江苏锐阳生物科技有限公司；柠檬酸、柠檬酸钠、氢氧化钠与95%乙醇均为分析纯；配制用水为二次蒸馏水。

1.2 仪器与设备

L750A型高速多功能摇摆粉碎机 浙江永康市红太阳机电有限公司；SHZ-D（Ⅲ）循环水式真空泵 巩义市予华仪器有限责任公司；HZQ-9240电热恒温鼓风干燥箱 上海一恒科学仪器有限公司；HH-S数显恒温水浴锅 江苏金坛金城国胜实验仪器厂；HC-3018R高速冷冻离心机 安徽中科中佳科学仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 工艺流程

1.3.2 工艺要点

1.3.2.1 原料预处理

将湿梨渣在温度80 ℃条件下烘24 h，至梨渣质量恒定得到干梨渣，将干梨渣粉碎，过60 目筛，得到梨渣粉。

1.3.2.2 半纤维素酶水解

将梨渣粉加入pH 4.6的柠檬酸缓冲液中，加入半纤维素酶，恒温水浴进行酶解，酶解后于100 ℃灭酶5 min，得到梨渣酶解液；将梨渣酶解液真空抽滤，分别收集滤渣和滤液；所述滤渣于温度80 ℃条件下烘24 h，至滤渣质量恒定，粉碎，即得IDF。

1.3.2.3 乙醇沉淀

滤液于60 ℃条件下真空浓缩40～60 min，直至浓缩液为原滤液的四分之一，按体积比1∶4向浓缩滤液中加入无水乙醇，静置沉淀24 h，温度20℃、转速5 000 r/min条件下离心10 min，倒出上清液，收集沉淀，分离出SDF。

1.3.2.4 干燥

将梨渣SDF在温度60 ℃条件下烘至质量恒定，粉碎，过60 目筛，得到粉状的梨渣SDF。

1.3.3 SDF提取的单因素试验

采用半纤维素酶水解法提取梨渣中SDF，在pH 4.6的柠檬酸缓冲液反应体系中，分别以液料比（6∶1、10∶1、14∶1、18∶1、22∶1（mL/g）、酶添加量（13.5、27.0、40.5、54.0、67.5 U/g）、酶解时间（3、4、5、6、7 h）、酶解温度（30、40、50、60、70 ℃）为影响因素，通过单因素试验考察其对膳食纤维提取率的影响。SDF提取率按以下公式进行计算：

1.3.4 SDF提取响应面优化试验

根据单因素试验结果，对各因素影响SDF提取率的结果做方差分析，选取对提取率影响显著的因素，设计Box-Behnken试验以优化SDF提取条件，获得较佳的提取工艺。选取的因素水平及编码如表1所示。

表1 响应面试验因素和水平Table1 Coded values and corresponding experimental values of the optimization parameters used in response surface analysis

2 结果与分析

2.1 SDF提取的单因素试验结果

2.1.1 液料比对SDF提取率的影响

取60 目的梨渣粉3 g于100 mL的烧杯中，加入0.05 mol/L、pH 4.6的柠檬酸缓冲液，将液料比定为6∶1、10∶1、14∶1、18∶1、22∶1（mL/g），然后加入40.5 U/g的半纤维素酶，在50℃恒温水浴酶解4 h，按1.3.2节所述进行后续操作，研究液料比对梨渣中SDF提取率的影响，结果如图1所示。

图1 液料比对SDF提取率的影响Fig.1 Effect of liquid/material ratio on the extraction rate of soluble dietary fiber

由图1可知，液料比在6∶1～ 14∶1（mL/g）范围内时，梨渣中SDF提取率随液料比的增大而升高，由12.98%升高到15.03%；当液料比大于14∶1时，梨渣中SDF提取率随液料比的增大而呈下降趋势。究其原因可能是：液料比小于14∶1时，酶解反应体系黏度较大，提取过程中搅拌较难操作，导致SDF扩散速率较慢，阻碍了酶对底物的水解，酶与底物反应不充分，SDF提取不完全而导致提取率较低；当液料比增大至18∶1后，由于反应体系过大，导致单位体积底物含量偏低，不利于酶与底物的结合，而使SDF提取率呈下降趋势[19]。同时，当液料比过大时，提取出来的SDF在溶液中的含量过低，不仅沉淀剂乙醇的消耗量大，而且沉淀效果也不理想，也会导致SDF提取率降低。方差 分析的结果显示，不同水平的液料比对SDF提取率的影响显著（P＜0.05）。在保证试验效果、节约能耗的前提下，液料比应控制在14∶1左右。

2.1.2 酶添加量对SDF提取率的影响

液料比14∶1、酶解温度50℃、酶解时间4 h的条件下，研究酶添加量对SDF得率的影响，结果如图2所示。

图2 酶添加量对SDF提取率的影响Fig.2 Effect of hemicellulase dosage on the extraction rate of soluble dietary fiber

由图2可知，酶添加量由13.5 U/g增加到67.5 U/g时，梨渣中SDF提取率总体上呈现先增加后降低的趋势。在酶添加量为54 U/g时，SDF提取率达到最大，为14.97%；当酶添加量大于54 U/g时，梨渣中SDF提取率又呈下降趋势。酶添加量在13.5～27 U/g范围内时，SDF提取率呈下降趋势，究其原因可能是由于操作误差；当将酶添加量由27 U/g增加到54 U/g时，反应体系中半纤维素酶对细胞壁的破环程度随酶添加量的增大而增大， 细胞内膜的通透性增加，传质阻力降低，同时，部分IDF也被酶解成小分子，溶解度增大，使部分IDF转变成SDF，因此，SDF提取率呈增加趋势[20-21]。而当酶用量过大时，在IDF水解得到可溶性成分的同时，部分可溶性大分子也被降解为醇溶性小分子物质，导致SDF提取率下降[22]。方差分析的结果显示，不同水平的酶添加量对SDF提取率的影响显著（P＜0.05）。

2.1.3 酶解时间对SDF提取率的影响

液料比14∶1、酶解温度为50℃、酶添加量54 U/g的条件下，研究酶解时间对SDF得率的影响，结果如图3所示。

图3 酶解时间对SDF提取率的影响Fig.3 Effect of hydrolysis time on the extraction rate of soluble dietary fiber

图3 结果显示，当酶解时间小于5 h时，SDF提取率随酶解时间的延长而增大；在5 h时，SDF提取率达到最大，为13.69%；酶解时间大于5 h后，SDF提取率随酶解时间的延长而降低。这是因为，在5 h以前，酶解时间过短，酶与底物反应不充分，所以SDF提取率较低，此时，SDF主 要成分为果胶；当酶作用时间在5 h左右时，酶解反应已基本完成，继续增加反应时间，就会将SDF转变为醇溶性小分子物质，导致SDF提取率下降[21′23-24]。方差分析的结果显示，酶解时间的变化对SDF提取率的影响高度显著（P＜0.01）。

2.1.4 酶解温度对SDF提取率的影响

液料比14∶1、酶解时间5 h、酶添加量54 U/g的条件下，研究酶解温度对SDF得率的影响，结果如图4所示。

图4 酶解温度对SDF提取率的影响Fig.4 Effect of hydrolysis temperature on the extraction rate of soluble dietary fiber

图4 结果显示，酶解温度对梨渣SDF提取率的影响较大。在30～50℃范围内时，随温度的升高，SDF提取率也升高；而在50℃以后，SDF提取率随温度的升高而降低，50℃时SDF达到最大，为14.24%。半纤维素与纤维素之间有较强的氢键，提取过程中破环氢键需要有较强的能量，温度升高，有利于纤维素与半纤维素之间氢键的破环，使半纤维素的溶解加强，SDF提取率也随之增加[25]；半纤维素酶的较适反应温度范围为30～60 ℃，当温度过高时，半纤维素酶变性失活，SDF提取率也随之降低，所以选取50℃为提取SDF的最佳提取温度。方差分析的结果显示，酶解温度的变化对SDF提取率的影响高度显著（P＜0.01）。

2.2 Box-Behnken试验设计与结果

由单因素试验结果可知，不同试验因素对梨渣SDF提取率的影响有所不同。对单因素试验结果的方差分析发现：酶添加量、酶解时间、酶解温度、液料比对SDF提取率的影响均为显著。因此，选用以上因素作为试验因素，设计Box-Behnken试验以优化提取条件，以SDF提取率为评价指标，确定半纤维素酶提取梨渣中SDF的较适条件。

2.2.1 模型的建立与显著性分析

Box-Behnken试验方案与结果如表2所示。利用Design-Expert 8.0.5b软件对表2中所得的数据进行分析，方差分析结果见表3。

因素经回归拟合，得到回归方程为：

Y=—108.509 69＋2.161 21A＋16.614 17B＋1.949 37C＋0.486 12D—2.75×10—3AB—8.56×10—3AC—9.4×10—3AD—0.144BC＋0.022BD＋0.018CD—0.015A2—1.53B2—0.053C2—5.008×10—3D2

由回归模型方差分析可知，回归模型P值均小于0.000 1，达到了极显著水平，说明该模型显著回归，方程能够正确反映梨渣SDF提取率与各因素之间的关系。模型的失拟项P值为0.228 4，大于0.05，表示其不显著，说明回归模型与实际实验拟合较好，试验误差小，不存在其他未考虑到的影响因素。一次项A、C、D及二次项A2、B2、C2和交互项AD表现为极显著，说明这几个因素对SDF提取率影响极大，且所考察因素对响应值影响不是简单的一次线性关系。交互项除AB、BD外都显著。根据F值大小，可知影响因素的主次顺序为：酶解温度＞酶添加量＞液料比＞酶解时间。此模型为0.963 7，表明有96.37%的提取率变异分布在所研究的4个相关因素中；多元相关系数R2为0.981 2，表明实测值和预测值间有很好的拟合度。方差分析结果表明采用响应面法设计所得的回归模型有效，可适用于梨渣SDF提取实验的理论预测。

表2 Box-Behnken试验优化方案与结果Table2 Box-Behnken design arrangement and corresponding experimental ressuullttss

表3 回归模型显著性检验及方差分析Table3 Significance test and analysis of variance for the regression model for enzymatic extraction off SSDDFF

2.2.2 响应面及等高线分析

响应面及等高线图能够直观地反映出各个因素及其交互作用，利用Design-Expert 8.0.5b软件即可以作出两因素交互作用的响应面及等高线图，结果见图5。

图5 各因素交互作用对SDF提取率影响的响应面及等高线图Fig.5 Response surface and contour plots showing the interactive effects of four process parameters on the extraction rate of SDF

从图5可以看出，除图5c外，图5a、b、d、e、f曲面图均显示出：随着各因素水平的升高或延长，SDF提取率先增加后减少。图5a、b、c的等高线图显示，等高线沿酶解温度轴向变化相对密集，而沿酶解时间、液料比与酶添加量轴向变化相对稀疏，再结合曲面图的陡峭程度，可得出：酶解温度对提取率的影响要大于酶解时间、液料比与酶添加量。同理，图5d、e的曲面图和等高线图显示酶解时间对SDF提取率的影响要弱于酶添加量和液料比；图5f响应面图和等高线图显示酶添加量对SDF提取率的影响要大于液料比。再次验证了单因素与交互项对SDF提取率的影响的主次顺序。

2.2.3 提取工艺的优化与验证

经Design-Expert 8.0.5b分析优化，可得到酶法提取梨渣中SDF的最佳工艺条件为液料比13∶1、酶解时间5.02 h、酶解温度57.59 ℃、酶添加量35 U/g。在此条件下，根据方程得到SDF提取率的预测值为15.38%。

表4 优化条件下的SDF提取率TTable 4 The extraction rate of SDF under optimized extraction condittiioonnss %

为了验证响应面优化的可行性，采用优化后的提取条件进行酶法提取梨渣中SDF的验证实验，同时，考虑到实验的可操作性，将实验条件设为液料比13∶1、酶解时间5 h、酶解温度58 ℃、酶添加量35 U/g，结果见表4。结果表明，采用上述优化条件提取时，SDF提取率是15.21%，与理论值相差1.1%，这说明响应面优化的条件是可行的，有较强的实用价值。

3 结 论

单因素试验结果表明酶解温度、酶添加量、液料比与酶解时间对砀山梨渣中SDF提取率的影响显著。试验方差分析表明影响SDF提取率的因素主次顺序为：酶解温度＞酶添加量＞液料比＞酶解时间。

砀山梨渣中SDF提取的较佳工艺条件为液料比13∶1、酶解时间5 h、酶解温度58 ℃、酶添加量35 U/g，在此条件下SDF提取率为15.21%，与理论值相差1.1%，结果表明实测值与理论值之间具有良好的拟合度。本实验所得模型对于优化砀山梨渣SDF半纤维素酶法提取工艺是合理的。

梨渣可作为一种提取优质膳食纤维的原料，半纤维素酶可有效作用于梨渣细胞壁，加速SDF的溶出，可用于梨渣SDF的提取。

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Applying Response Surface Methodology to Optimize Extraction of Soluble Dietary Fiber from Pear Residue Using Hemicellulase

CHEN Xiaoju1,2′WU Xuefeng2′JIANG Shaotong2′LI Xingjiang2′*
(1. School of Chemical Engineering and Life Sciences Chaohu University Chaohu 238000′China; 2. School of Biotechnology and Food Engineering Hefei University of Technology Hefei 230009′China)

Soluble dietary fiber (SDF was extracted from pear residue by hemicellulase hydrolysis The optimum extraction conditions for SDF were determined using response surface methodology (RSM). The effects of four crucial parameters including liquid/material ratio hemicellulase dosage hydrolysis temperature and time on the extraction rate of SDF were investigated by single factor experiments A Box-Behnken design (BBD consisting of 29 experimental points with five replications at the center point was used to investigate the interactive effects of the four independent variables at three levels ranging from 10:1 to 18:1′from 35 to 55 U/g from 40 to 60 ℃′and from 4 to 6 h respectively on extrac tion efficiency The maximum extractio n rate of SDF (15.21%)′which agreed with the predicted value (15.38%)′was obtained when the extraction experiment was carried out for 5 h at 58 ℃ with a hemicellulase dosage of 35 U/g at a liquid/material ratio of 13:1 (mL/g). Thus it is feasible to use hemicellulase to extract SDF from pear residue.

pear residue soluble dietary fiber hemicellulas

TS201.1

A

1002-6630（2015）06-0018-06

10.7506/spkx1002-6630-201506004

2014-08-11

国家自然科学基金青年科学基金项目（31101352）；国家自然科学基金面上项目（31470002）；巢湖学院科研启动项目（KYQD-201402）

陈小举（1984—），男，博士，研究方向为生物资源综合利用。E-mail：chenxiaoju2012@hotmail.com

*通信作者：李兴江（1978—），男，副教授，博士，研究方向为食品发酵工程。E-mail：lixingjiang1978@hfut.edu.cn