苹果赤霉素3-氧化酶1(MdGA3ox1)在烟草中的表达研究

赵慧君，余海忠，王海燕，朱文权



苹果赤霉素3-氧化酶1()在烟草中的表达研究

赵慧君，余海忠，王海燕，朱文权

(湖北文理学院化学工程与食品科学学院，湖北襄阳 441053)

近年来在拟南芥、水稻等物种中对赤霉素生物合成途径的研究日益完善，但苹果中的赤霉素生物合成途径尚未明确. 文章通过构建苹果GA-3氧化酶基因的植物表达载体，并将该基因通过农杆菌介导法转化到烟草中来快速验证其在植物中的功能. 结果发现：对烟草的表型产生了很大的影响，既有赤霉素过量的典型表型，也有非典型的表型. 造成这种表型的原因可能有两个：一是在烟草赤霉素生物合成途径中，不是最关键的基因；二是基因的表达需要特定的的转录因子，在烟草中的启动子和苹果中不同，结合的转录因子也不同，从而造成了表型的多样化.

赤霉素；苹果；；烟草

赤霉素是一种非常重要的植物激素，参与调控植物生长发育的各个过程. 研究发现，GA3-氧化酶(gibberellin 3-oxidase, GA3ox)介导一个3β-羟基基团到GA9和GA20上，生成有生物活性的GAs，GA1和GA4. 编码赤霉素生物合成和代谢途径的基因已经在几个植物中(包括拟南芥、水稻、南瓜和烟草)被克隆出来[1-3]，但苹果中赤霉素生物合成和代谢途径依然尚不清楚.

苹果种子的液体胚乳通过一系列代谢，可以把甲羟戊酸转化成GA[4]. 通过化学方法确定了在苹果的未成熟种子中有GAs[5]. GA还参与了苹果威塞克短枝型生长习性的建立[6]. 但是苹果中赤霉素生物合成途径在分子生物学方面的进展是苹果基因的克隆[7]. Northern分析这个基因在未成熟的种子中表达量最高. 盛花后1~3个月，苹果果实中的mRNA水平积累到非常高的水平，在早期和成熟后没有检测到有mRNA积累. 转录水平的增加与果实的快速增大是一致的. 这与Luchwill报道是一致的. Paris发现，果实的生长速度通常与种子数一致，外施GA可以加快果实生长. 当种子被去除时，GA也可以取代种子的作用[8]. Bulley从栽培品种绿袖(James Grieve x Golden Delicious)中克隆了两个相似性很高的基因，分析显示在发育中的胚乳具有很高的表达水平，花药和雌蕊中表达很弱，种皮中没有检测到这个基因表达. 酶分析显示具有的活性，而只能把[14C]GA12转化为GA15. 通过农杆菌介导的方法把干扰载体转化到绿袖中得到了两个矮化株系：一个单拷贝，一个多拷贝. 它们都表现为节间变短和减少，叶片变小. 外施GA3只能把节间的数目和长度恢复到野生型，对叶片大小和下胚轴长度没有影响. 与野生型相比，转基因植株的叶片和茎尖的GA19增加，GA20和GA1减少[9].

本课题组从苹果中克隆了，并通过一系列的实验证明了这是一个在花中表达的基因，且具有功能. 本文目的是验证苹果GA氧化酶基因在植物中的功能，为进一步在苹果中应用该基因搭建平台，通过转基因的方式实现苹果的品种改良，为植物品种的改良提供新思路.

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1菌株与质粒

根癌农杆菌EHA105由本实验室保存，pCAMBIA1302 购买自CAMBIA公司.

1.1.2植物材料

转苹果GA氧化酶基因烟草种子，开放阅读框的引物.

1.1.3 MS培养基

MS培养基(1L)：MS大量元素50mL，MS微量元素5mL，MS有机5mL，Fe盐5mL，蔗糖30g，pH5.8(固体培养基每升加8g琼脂粉)，高压灭菌；

MS大量元素：KNO338 000mg/L, NH4NO333 000mg/L, CaCl2·2H2O 8 800mg/L, MgSO4·7H2O 7 400mg/L, KH2PO43 400mg/L，配成20X母液；

MS微量元素：KI 166mg/L，H3BO31 240mg/L，MnSO4·4H2O 4 460mg/L，ZnSO4·7H2O 1 720mg/L，NaMO450mg/L，CuSO4·5H2O 5mg/L，CoCl2·6H2O 5mg/L，配成200X母液；

MS有机：肌醇 20 000mg/L，烟酸 100mg/L，盐酸吡多醇 100mg/L，盐酸硫胺素 100mg/L，甘氨酸 400mg/L，配成200X母液；

Fe盐：FeSO4·7H2O 5 560mg/L，Na2EDTA·2H2O 7 460mg/L，配成200X母液.

1.1.4酶及试剂

羧苄链霉素(Cb)购自北京欣经科生物技术有限公司，潮霉素B(hpt)购自索莱宝科技有限公司. 本论文中所用的各种限制性内切酶、RNaseA、dNTP、Taq DNA Polymerase等购自Takara生物工程公司.

1.2 实验方法

1.2.1烟草种子的发芽和小苗种植

1)用次氯酸钠消毒种子8分钟后，用无菌水洗涤6次；2)把种子播在MS培养基上，在光照培养箱培养两周，观察根长和上胚轴变化；长出真叶后将小苗转移到有MS培养基的瓶子中继续生长；3)生长一个月后，转移到土里生长，观察表型.

1.2.2转基因烟草植株在DNA水平上的检测

用CTAB法提取转基因烟草的DNA，用扩增开放阅读框的引物，以转基因烟草DNA为模板，进行PCR扩增鉴定转基因烟草植株.

1.2.2.1 DNA的提取

1) 取冷冻保存或新鲜的转基因烟草，液氮下研磨，然后转移到液氮预冷的1.5mL离心管中，加入500μL CTAB DNA提取缓冲液，65℃水浴1hr，每隔15min上下颠倒一次；

2) 从水浴中取出后，冷却至室温，加入500μL24:1的氯仿/异戊醇，上下轻柔颠倒混匀；

3) 12 500rpm离心15分钟，取上清，加入500μL24:1的氯仿/异戊醇，上下轻柔颠倒混匀；

4) 如果中间层蛋白质过多，重复步骤2；

5) 12 500rpm离心15分钟，取上清，加入2.5倍体积的无水乙醇，冰箱冷藏沉淀30分钟；

6) 12 500rpm离心15分钟，弃上清，用70%乙醇洗涤沉淀，12 500rpm收集沉淀；

7) 干燥沉淀，用50μL含有RnaseA的TE溶解沉淀.

1.2.2.2 聚合酶链式反应(PCR)扩增DNA片段

1)在PCR管中加入适量缓冲液、模板DNA、dNTP，正向引物、反向引物和Taq酶，混合均匀后，短暂离心收集于管底；2)设定PCR程序，94℃，5min；94℃ 1min，52℃ 1min，72℃ 1min，35个循环；72℃ 5min. 把样品放入PCR仪进行扩增；3)扩增结束后，琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果.

表1 标准PCR反应体系

1.2.3表型统计方法

幼根根长的比较，取样方法为：转基因和野生型的烟草种子播在基本MS培养基上，在光照培养箱生长2周，把在光照培养箱里生长两周的烟草种到土里，每周浇一次水. 待烟草苗长大后，取完全展开的叶片，量取纵径和横径的长度. 开花时间是以看见花蕾为信号，比较转基因烟草与野生型烟草的开花时间长短. 待开花后，对整个植株的节间数进行比较. 对于节间长度的比较是开花后取从下往上数第三、五节间的长度进行比较. 对于叶面积、开花时间、节间数、节间长度的比较则取10棵同一株系，进行数据采集.

2 结果与分析

2.1 转基因烟草的分子鉴定

提取转基因烟草的DNA后进行PCR扩增，检测结果见图1，可以看出，正对照扩出明亮的条带，负对照没有条带，是符合正负对照要求的，3-13中，只有6、8、11和13扩增出了和正对照一样的条带，说明他们是转MdGA3ox1基因的烟草. 待6、8、11和13转基因烟草结出种子后，进行后面的实验.

图1 转基因烟草的检测鉴定

注：M marker; 1正对照; 2负对照; 3-13转基因烟草的PCR结果

图2 转基因烟草幼苗与对照的表型比较

2.2 转基因烟草的表型变化

2.2.1转基因烟草幼苗期的表型变化

转基因烟草种子经次氯酸钠消毒后种植在MS基本培养基上，放入光照培养箱里萌发. 生长两周后移植到土里. 在土中生长两周后，观察转烟草与对照烟草(CK)的异同(图2). 从图2中可以看出，转基因烟草与对照相比没有明显的区别，出现这种现象的原因可能是在烟草中不是一个最关键的基因.

2.2.2转基因烟草表型变化

从下图3可以看出，转基因的烟草株高增加(图3a)，成熟叶片的面积明显大于野生型对照(CK)，叶片狭长，且叶片褶皱，叶柄缩短至几乎没有(图3b).

ab

从表2中数据可以看出，与野生型相比，长大后的转烟草表现出赤霉素过量的表型，植株细长，节间增长，总体表现为开花提前，节间数减少，植株的高度减小，千粒重减少，节间长度总体减小，叶片横径、纵径均增大. 赤霉素在植物中的主要作用包括促进植物开花和节间伸长，这与转基因烟草开花时间提前是相对应的. 但是烟草叶片表型的变化不是过表达的典型性状，这表明在烟草中，可能有未知的功能.

表2 MdGA3ox1转基因烟草与对照的统计学分析

3 结语

赤霉素对植物的整个生长发育过程都有作用，从种子萌发时期，种子吸涨激活赤霉素生物合成途径中基因的表达，赤霉素的出现刺激α-淀粉酶的合成，开始消化淀粉为种子的萌发提供能量物质. 在整个生长阶段，赤霉素对茎秆的伸长，叶片的扩大都有重要的作用，缺乏赤霉素将造成植物矮秆的表型. 针对赤霉素的这种性质，上世界50年代掀起了植物育种的“绿色革命”. 这也是植物分子育种中的一个重要切入点. 苹果属于高大的乔木，在种植过程中的各个操作都较为困难. 矮化育种是苹果育种的一个重要的方向.

根据以往的研究发现，是赤霉素生物合成途径的一个关键酶基因. 本课题组从富士苹果中克隆了，经过体外生化实验、组织特异性表达等实验证明了它是一个有功能，主要在花中表达的基因. 为了进一步验证在植物中的功能，我们构建了的植物表达载体，并通过农杆菌介导的方法转化到烟草中. 通过对转基因烟草表型的观察，推断在苹果中的功能.

本课题组分别对转基因烟草的根长、植株高度、植株节间数和节间长度、叶片大小、千粒重等指标进行了考察. 结果表明，对烟草的表型产生了很大的影响，既有赤霉素过量的典型表型，也有非典型的表型. 造成这些表型的原因可能有两个，一是在烟草赤霉素生物合成途径中，不是最关键的基因；二是基因的表达需要特定的的转录因子，在烟草中和苹果中的启动子不同，结合的转录因子也不同，从而造成了表型的多样化.

[1] HEDDEN P, KAMIYA. Gibberellin biosynthesis: Enzymes, Genes and Their Regulation[J]. Annu Rev Plant Biol, 1997(48): 431-460.

[2] LANGE T. Molecular biology of gibberellin synthesis[J]. Planta, 1998, 204(4): 409-419.

[3] YAMAGUCHI S. Gibberellin metabolism and its regulation[J]. Annu Rev Plant Biol, 2008(59): 225-251.

[4] LUCKWILL LC, WEAVER P, MACMILLAN J. Gibberellins and other growth hormones in apple seeds[J]. J Horti Sci, 1969(44): 413-424.

[5] HEDDEN P, HOAD GV, GASKIN P, et al. Kaurenoids and gibberellins, including the newly characterized gibberellin A88, in developing apple seeds[J]. Phytochemistry, 1993(32): 231-237.

[6] LOONEY NF, TAYLOR JS, PHARIS RP. Relationship of endogenous gibberellin and cytokinin levels in the shoot tips to apical form in the four strains of MnIntosh apple[J]. J Am SocHorti Sci, 1988(113): 395-398.

[7] KUSABA S, HONDA C, KANO-MURAKAMI Y. Isolation and expression analysis of gibberellin 20-oxidase homologous gene in apple[J]. J Exp Bot, 2001(355): 375-376.

[8] PHARIS RP, KING RW. Gibberellins and reproductive development in seed plants[J]. Annu Rev Plant Physiol, 1985(36): 517-568.

[9] BULLEY SM, WILSON FM, HEDDEN P, et al. Modification of gibberellin biosynthesis in the grafted apple scion allows control of tree height independent of the rootstock[J]. Plant Biotech, 2005(3): 215-223.

Expression of Apple GA 3-oxidase 1() in Tobacco

ZHAO Huijun, YU Haizhong, WANG Haiyan, ZHU Wenquan

(School of Chemical Engineeringand Food Science, Hubei University of Arts and Science, Xiangyang 441053, China)

In recent years, gibberellin (GA) biosynthetic pathway has been improved in arabidopsis, rice and other species. But GA biosynthetic pathway is not yet clear in apple. In this paper,expression vector in plants was constructed and was transferred to tobacco by agrobacterium-mediated method to quickly verify gene function . The results showed that:tobacco phenotype had a great influence, both GA excess of typical phenotype, but also atypical phenotypes. The reason for this phenotype may be two, onenot the most critical gene in the tobacco gibberellin biosynthetic pathway; the second is the expression of the gene requires specific transcription factors, in tobacco and appleshas different promoters, and then binding different transcription factor, resulting in diverse phenotypes.

Gibberellins; Apple;; Tobacco

(责任编辑：徐 杰)

Q785

A

2095-4476(2015)02-0017-04

2014-11-10;

2015-01-06

赵慧君(1979— ), 女, 河南范县人, 湖北文理学院化学工程与食品科学学院讲师, 博士