补肾健脾中药对复发性流产小鼠蜕膜血管内皮生长因子、微血管密度表达的影响

李伟莉，熊程俏

(安徽中医药大学第一附属医院妇科，安徽合肥 230031)

复发性流产(recurrent spontaneous abortion，RSA)是妇产科临床中较为常见的疾病，在育龄妇女中其发生率约占1% ～2%，同时又占所有妊娠丢失的15% ～20%。复发性流产在中医称为“滑胎”，其具有屡孕屡堕的特点，这与人类生活节奏的加快和环境的变化等因素密切相关，随着连续流产次数的增加，流产反复发生的倾向也越来越大。当自然流产连续发生1、2、3次后，临床上再次妊娠后流产的风险则逐渐升高，分别为 13%、37%、84%［1］，大量的研究表明该病与遗传、免疫、内分泌、感染及血栓形成等诸多因素有关。临床自然流产多继之于胚胎停止发育，研究显示与母胎界面的血管生成有关［2-4］。血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)作为最主要的血管生成相关因子，在血管生成中起到重要作用。我们既往的研究表明补肾健脾中药(补肾安胎冲剂)治疗自然流产的患者有很好的临床疗效［5-7］，具有调节内分泌免疫紊乱的作用。本研究拟通过建立复发性流产小鼠模型观察复发性流产小鼠蜕膜VEGF及微血管密度(microvessel density，MVD)的表达及中药干预，探讨补肾健脾中药对蜕膜血管生成的影响，为中药保胎提供科学依据。

1 实验材料

1.1 实验动物 雌性CBA/J小鼠，雄性DBA/2及BALB/c小鼠，由安徽省实验动物中心提供(许可证号:许可证号:scxk［皖］2011-002)。

1.2 药物及试剂 补肾安胎冲剂组成:菟丝子、川断、桑寄生、熟地、太子参、白术、黄芩等，由安徽中医药大学第一附属医院制剂室提供(BZ20080017);黄体酮胶囊:浙江仙琚制药股份有限公司生产，规格:50 mg×20粒(120638)。

1.3 实验仪器及试剂 自动包埋机(TB-718，德国莱卡);病理切片机(LEICA RM2135，德国莱卡);显微图象分析系统(BX51荧光显微镜，DP70数码摄像装置，JD形态分析系统，日本OLYMPUS)。Ribbit Anti-VEGF(980896W，bioss)，Ribbit Anti-CD34(980207W，bioss);PV-6000(K127719A)，DAB 显色试剂盒均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

2 实验方法

2.1 模型复制与分组 采用具有隐性、反复性和父系特异性特征的DBA/2XCBA的Clark经典反复流产小鼠模型［8］。将雌性CBA/J小鼠分别与雄性DBA/2及BALB/c小鼠分别按2∶1合笼交配，分别建立RSA模型CBA/J×DBA/2与正常妊娠模型CBA×BALB/c，雌雄2∶1分笼饲养检出阴栓者计为妊娠第0天。将68只雌鼠随机分为:正常组、模型组、西药(黄体酮)组、中药(补肾安胎冲剂)组。正常组、模型组给予蒸馏水灌胃;西药组予黄体酮胶囊(0.4 mg·kg-1·d-1)灌胃;中药组予补肾安胎冲剂(3.0 g·kg-1·d-1)灌胃，各组均 15 d。

2.2 样本采集 末次给药24 h后，处死小鼠剖腹并完整分离留取卵巢、子宫组织，去除周围结缔组织，取一侧子宫置于10%中性福尔马林固定备用;另一侧子宫装入冻存管中，置于-80℃保存备用。

2.3 流产率的计算 正常胚胎粗大如串珠状，宫内未见瘀血，胚胎呈淡红色;流产胚胎宫内见明显瘀血，胚胎呈黑褐色，或子宫呈竹节样改变，或仅见到胚胎着床点，或胚胎已完全或部分消失。流产率=流产胚胎数/(流产胚胎数+正常胚胎数)×100%。

2.4 指标检测 参照二步法免疫组化检测试剂盒(PV-6000)和 DAB酶底物显色试剂盒的说明书要求进行操作，检测VEGF及MVD的表达情况。以细胞胞浆、胞核中出现黄色或棕褐色颗粒为阳性反应。采用江苏捷达JD-801图像分析系统，在相同视野下，对免疫反应阳性细胞的积分光密度进行分析。

2.5 统计学分析 采用SPSS11.5统计软件进行数据分析。计量资料数据以均数±标准差(±s)表示，均通过正态性检验。多组间的比较采用单因素方差分析+多重比较。显著性水准α=0.05。

3 结果

3.1 各组流产率的比较 与正常组相比较，模型组的流产率显著升高(P＜0.01);与模型组相比较，西药组及中药组小鼠流产率显著降低(P＜0.01)，见表1。

表1 各组小鼠流产率的比较(±s)

表1 各组小鼠流产率的比较(±s)

组别 例数 流产率/%A:正常组17 2.08 ±1.09 B:模型组 17 70.59 ±16.85 C:西药组 17 36.76 ±15.51 D:中药组 17 29.71 ±16.25整体比较:F，P 84.67，0.000多重比较:LSD-t，P A vs B 15.85，0.000 A vs C 8.03，0.000 A vs D 6.39，0.000 B vs C 7.23，0.000 B vs D 8.74，0.000 C vs D 1.51，0.136

3.2 各组VEGF在蜕膜中的表达情况 在正常组、西药组及中药组小鼠蜕膜中，VEGF主要表达于腺上皮细胞和血管内皮细胞胞浆中。与正常组比较，模型组中VEGF的表达均减少(P＜0.05)。与模型组比较，西药组及中药组小鼠蜕膜中VEGF表达显著升高(P ＜0.05或 P ＜0.01)。见表2，图1。

表2 各组蜕膜中VEGF积分光密度值(IOD)的比较(±s)

表2 各组蜕膜中VEGF积分光密度值(IOD)的比较(±s)

组别 例数VEGF A:正常组17 4.24 ±1.48 B:模型组 17 3.09 ±0.58 C:西药组 17 3.88 ±0.97 D:中药组 17 4.17 ±1.02整体比较:F，P 2.71，0.013多重比较:LSD-t，P A vs B 2.45，0.021 A vs C 0.78，0.446 A vs D 0.15，0.885 B vs C 2.66，0.017 B vs D 2.71，0.009 C vs D 0.64，0.535

3.3 各组蜕膜中MVD表达的比较 用CD34单克隆抗体标记血管内皮细胞，并进行着色的微血管计数。与正常组相比较，模型组小鼠蜕膜中MVD表达显著降低(P＜0.05);与模型组相比较，西药组及中药组小鼠蜕膜中MVD表达显著升高(P＜0.05或 P ＜0.01)。见表3，图2。

表3 各组蜕膜中MVD的比较(±s)

表3 各组蜕膜中MVD的比较(±s)

组别 例数MVD A:正常组17 17.90 ±6.01 B:模型组 17 7.60 ±3.44 C:西药组 17 14.82 ±5.06 D:中药组 17 15.60 ±5.15整体比较:F，P 7.93，0.000多重比较:LSD-t，P A vs B 4.60，0.000 A vs C 1.41，0.167 A vs D 1.03，0.310 B vs C 3.30，0.002 B vs D 3.57，0.001 C vs D 0.36，0.723

4 讨论

正常妊娠需要母胎界面具有丰富而完善的血管网络，早期妊娠中母体与胎儿之间血管的发育及其网络的形成是保证营养物质进行正常交换的前提，对胚胎的存活起着十分重要的作用。与正常妊娠相比，临床上流产是一种常见的病理妊娠，研究表明随着妊娠次数的增加其反复发生流产的风险也随之增加，因此，研究蜕膜中血管的发育和形成对正常妊娠有着十分重大的意义。VEGF作为主要的血管内皮生成因子，具有促进内皮细胞增殖和调控血管生成的作用。基于流产患者蜕膜组织的研究表明，VEGF表达减少或不表达，可导致血管网形成不良或滋养细胞分化、浸润异常，最终导致流产的发生［9］。MVD是显示血管形成活性的重要指标，它反映了组织中血液灌注的情况。

本研究结果表明正常组孕鼠VEGF及MVD的表达均显著高于模型组，说明模型组蜕膜中血管的数量明显低于正常组，这与报道流产患者蜕膜血管发育不良，表现为血管数目少、管腔狭小或无明显管腔、腔内血细胞少、血管发育不良的状态［10］是一致的，因此，复发性流产小鼠存在VEGF及MVD表达的显著降低，从而影响蜕膜中血管不能正常发育，最终导致流产的发生。与模型组相比，中药组VEGF及MVD表达显著升高，同时，其流产率显著降低，则提示补肾健脾中药的干预，可能通过调节提高VEGF及MVD的表达，从而促进血管生成，为母胎之间提供充足的营养，降低流产的发生。

补肾安胎冲剂(菟丝子、川断、桑寄生、熟地、太子参、白术、黄芩等)是以补肾健脾之法为主进行组方，经过多年临床经验积累所制成的院内制剂，其临床疗效十分显著［11］，本方中以菟丝子、太子参为君，菟丝子补肾固精;太子参补脾肾之气，益生殖之精。桑寄生补肾调肝;川断补肝肾，调血脉;熟地养血益精;白术补脾益胃共为臣药。黄芩清热凉血安胎，与白术相配见朱丹溪“安胎圣药”之妙。全方切中流产脾肾亏虚的病机，补肾健脾使血足气旺，冲任协调，补先天益后天，共奏安胎之功。中医认为肾主生殖，主藏精，为先天之本，胞脉系于肾，肾气旺盛是女性生殖之本，肾气旺盛、气血充足、冲任协调才能使血旺养胎，这一点与妊娠期母胎之间的血管生成相似［12-13］。本研究结果也显示，补肾健脾中药能上调其VEGF及MVD的表达，促进血管的形成，为胚胎提供充足的血供，降低了流产率，从而为蜕膜血管方面中药保胎作用机制的研究奠定了基础。

综上所述，复发性自然流产小鼠存在VEGF及MVD表达的降低，影响蜕膜血管的发育，导致流产发生。补肾健脾中药能上调VEGF及MVD的表达，促进血管的形成，丰富母胎之间的血管网络，促进胚胎生长发育。然而，中药干预保胎的具体作用机制，还有待进一步探讨。

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