载大黄酸的空腔纳米球在大鼠体内的血药浓度测定※

牛慧敏 张好平 钱 庄 赵建华 韩 刚 刘占军

载大黄酸的空腔纳米球在大鼠体内的血药浓度测定※

牛慧敏 张好平 钱 庄 赵建华 韩 刚 刘占军

目的 探讨高效液相色谱（HPLC）测定载大黄酸的空腔碳酸钙（CaCO3）纳米球血药浓度，以评价其在大鼠体内缓释效果。方法 采用HPLC法测定大鼠灌胃载大黄酸CaCO3纳米球后不同时点大鼠血药浓度。结果 大鼠灌胃10 mg/kg的载大黄酸CaCO3纳米球后20 min检测到大黄酸，40 min后达到最大血药浓度，之后释放速度减慢，表明大黄酸CaCO3纳米球在大鼠体内具有良好的缓释性能。结论 大黄酸以空腔CaCO3纳米球作为载体，在大鼠体内能够达到良好的缓释效果。

大黄酸；空腔纳米球；缓释；血药浓度

大黄酸（Rhein）是大黄游离蒽醌衍生物之一，是从大黄、何首乌、虎杖等多种传统中药分离提取出的有效成分。现代研究表明，大黄酸具有广泛的药理活性，具有抗肿瘤、抗炎、抗菌、调节肾功能等作用[1-2]。大黄酸能有减少蛋白尿的排泄、抑制细胞外基质的产生以及减轻肾小球硬化等，可明显改善遗传性糖尿病小鼠的肾损伤[3-4]。大黄酸还能通过减轻肾脏肥大、改善胰岛素敏感性、纠正脂质代谢紊乱及血流变学紊乱等，有效防治2型糖尿病肾病的发生[5]。然而，大黄酸在水中溶解度低、溶出速度慢因而生物利用度低。提高难溶性药物的溶解度和溶出度，是提升药物生物利用度的有效途径之一。

近年来，空腔纳米球（hollow nanospheres, HNPs）作为一种新型控释材料，得到了越来越多的关注。相比于实心的纳米粒，这种空腔纳米球内部巨大的空腔部分，使载药的容量有了极大程度的提高，更适合应用于药物的包载，药物分子一旦进入空腔，能被屏蔽于体液之外，不至于发生反应和降解。碳酸钙（CaCO3）是一种应用广泛的无机化合物。尤其是空腔结构的 CaCO3可以用作药用载体和诊断标志物，如其他的空腔纳米球相同，除了具有优越的生物相容性外，还可生物降解，在体内具有很好的酸度响应性[6-7]。所以利用碳酸钙制备成空腔纳米球，用于载药，具有比其他无机材料更大的优势。

本课题组通过利用壳聚糖接枝丙烯酸和甲基丙烯酸甲酯为模板，制备的空腔CaCO3纳米球具有良好的载药量和体外缓释效果。本实验通过将自制的空腔 CaCO3纳米球负载大黄酸对大鼠进行灌胃实验，测定不同时点大鼠血液中的浓度，以评价空腔纳米球在大鼠体内的释放情况。为大黄酸制剂的开发和空腔CaCO3纳米球的应用提供参考。

1 仪器与试剂

1.1 药品与试剂 空腔CaCO3纳米球，本课题组利用壳聚糖接枝丙烯酸和甲基丙烯酸甲酯模板法自制；大黄酸对照品，中国药品生物制品检定所，批号：0757-200206；色谱纯甲醇，美国Fisher公司。

1.2 仪器 1200型高效液相色谱仪（美国Agilent公司）；BP211D电子天平（赛多利斯）；KDC-16H高速离心机（科大创新公司）；SIB-1型快速混匀器（江苏医疗仪器厂）；氮吹仪（天津奥特赛恩斯公司）；RE-52A旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）。

1.3 动物 清洁级SD大鼠，由河北省联合大学实验动物中心提供，合格证号：SCXK-（京）2006-03-30。雄性，体质量200～240 g。

2 方法与结果

2.1 动物分组与给药 SD大鼠20只，适应性饲养1周后，随机分为两组，实验前12 h禁食不禁水。一组按大黄酸10 mg/kg的剂量大黄酸CaCO3纳米粒灌胃，用1%的羧甲基纤维素钠制成混悬液灌服，另一组作为空白。将灌好胃的大鼠，腹腔注射水合氯醛溶液麻醉后，于给药后0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0 h大鼠眼眶静脉丛取血0.4 ml于肝素化试管中，离心取上层血浆于 2 ml的离心管中，-20 ℃低温保存，备用。

2.2 色谱条件选择 色谱柱：Diomansil C18（4.6 mm×150 mm，5 μm），流动相：甲醇-水-冰醋酸（77:22:1）；柱温：25 ℃；流速：1.0 ml/min；检测波长：428 nm[8]。

2.3 大黄酸对照品溶液制备 精密称取大黄酸对照品3 mg于10 ml容量瓶，用甲醇稀释至刻度得对照品溶液。

2.4 空白血浆加对照品样品 处理精密吸取一定体积的对照品溶液，常温下用氮气吹干后精密加入0.2 ml空白血浆，振荡3 min，加入1.75 ml色谱纯甲醇，振荡3 min后离心（离心力1060×g，4 000 r/min，离心5 min），取上清液，50 ℃水浴氮气吹干，加适量色谱纯甲醇在漩涡混合仪中振荡溶解，通过0.45 μm微孔滤膜过滤即为空白血浆对照品溶液。

2.5 空白血浆及含药血浆样品处理 取血浆样品0.2 ml于的2 ml离心管中，加入1.75 ml色谱纯甲醇，振荡3 min后离心（离心力1060×g，4 000 r/min，离心5 min），取上清液，50 ℃水浴氮气吹干，加甲醇200 μl，然后在漩涡混合仪上振荡溶解，再通过0.45 μm微孔滤膜过滤。

2.6 方法专属性 为考查血浆样品中是否存在内源性物质影响测定，分别取大黄酸CaCO3纳米球、空白血浆及空白血浆加大黄酸标准品灌喂大鼠后的血浆各20 μl，进样，同时取一份大黄酸对照品20 μl进样。结果见图1。实验发现，对照品C图中大黄酸的保留时间为4.279 min。大黄酸加入空白血浆后及灌胃大黄酸纳米粒的大鼠血浆色谱图响应位置上，有相同保留时间的色谱峰（图 1B、D），且空白血浆样品无干扰。

图1 HPLC色谱图

2.7 标准曲线绘制 吸取大鼠空白血浆100 μl，加入精密大黄酸对照品溶液适量，置于离心管内，制得大黄酸浓度分别为1.0、3.0、5.0、7.0、9.0、11.0、13.0、15.0 μg/ml的血浆样本，进样20 μl分析，以大黄酸对照品峰面积A对大黄酸血药浓度B进行线性回归，得线性回归方程：A=27.934X+1.716（r=0.9993），大黄酸在1.0～15 μg/ml范围线性关系良好。

2.8 精密度试验 配制大黄酸对照品高、中、低浓度分别为1.0、6.0、12.0 μg/ml的血浆样品，每个浓度5份样品，在1 d内测定样品，考查本方法的日内精密度。结果测得平均RSD值为5.18%。连续3 d分析样品，考察方法日间精密度，每天测定1次，连续测定5 d。测得不同浓度的平均RSD值为6.27%。

2.9 回收率试验 分别取1.0、6.0、12.0 μg/ml大黄酸对照品溶液，用氮吹仪吹干，加色谱纯甲醇100 μl溶解，进样测定，记录大黄酸峰面积（A），另加入“2.3”项下配制的大黄酸对照品的血浆样本，每组样品的高、中、低浓度分别为1.0、6.0、12.0 μg/ml，每个浓度5份样品，以20 μl进样分析，分别记录大黄酸峰面积（S），S值比A值，计算可得大黄酸的平均提取回收率为89.36%。符合药物动力学研究要求。

2.10 稳定性试验 按“2.3”项方法，配制低、中、高3种浓度分别为1.0、6.0、12.0 μg/ml大黄酸血浆样品，在-20 ℃冻存5 d，反复冻融3次，室温放置6 h。进样20 μl分析，结果得低、中、高3种浓度的血浆样品平均RSD为5.19%。表明该样品符合测定要求。

2.11 对不同时点血浆样品进行高效液相色谱（HPLC）检测 将SD大鼠灌胃后取出的不同时间点的血浆样品，按照血浆样品的处理方法处理后得到不同时点 0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0 h的样品，按照上述色谱条件，取20 μl进行进样分析，根据标准曲线计算出各个时点峰面积所对应的大黄酸浓度（μg/ml）并用时间-血药浓度来作图，可得到血药浓度变化曲线（图2）。

图2 血药浓度的变化曲线

3 讨论

本文通过实验，建立了HPLC测定空腔CaCO3纳米球的血药浓度方法，结果表明，该方法准确灵敏，能满足生物样品分析要求，可用于空腔CaCO3纳米球的血药浓度测定。在不同时点对大鼠灌胃后空腔CaCO3纳米球的血药浓度监测中发现，大鼠经灌胃后20 min中后可监测到大黄酸，40 min后释放速率达到最大值，之后释放速率减缓。从释放曲线可看出，大黄酸经由空腔CaCO3纳米球负载后，大黄酸随纳米球吸收进入体内，释放入血的速度明显减慢，停留在纳米球内，不断由载体中缓慢释放出来。由于药物从纳米球中的释放要比药物从原药或其他混合剂型向血液中扩散的速度慢，从而提高了药物的生物利用度[9]。同时证明作为药物载体时能明显延长药物释放时间，该纳米制剂可进入体内循环，为空腔CaCO3纳米球在大鼠体内的全面药代动力学研究提供了实验依据。

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Carrier Rhein Cavity Nanospheres Serum Concentrations Measured in Rats in Vivo

Niu Huimin Zhang Haoping Qian Zhuang Zhao Jianhua Han Gang Liu Zhanjun

Objective To explore the method of high performance liquid chromatography(HPLC)determination of Rhein loaded cavity calcium carbonate (CaCO3) concentration in blood of nano ball,so as to evaluate the sustained release effect in rats in vivo.Methods Using the HPLC method for the determination of rats administered with carrier rhein CaCO3nanoparticles at different time points after the rat blood drug concentration.Results Rats were gavaged with 10 mg/kg carrier rhein CaCO3nanospheres after 20 min detect rhein,40 min after the maximum blood concentration after release,slow down,show the rhein CaCO3nanospheres with good sustained release performance in rats. Conclusion Retinoic acid on the cavity CaCO3nanoparticles as a carrier,in rats can achieve good effect of extended release.

Rhein;Hollow nanospheres;Sustained release;Blood concentration

R285.5

A

1673-5846(2015)03-0017-03

河北联合大学药学院，河北唐山 063000

河北省自然科学基金-石药集团医药联合研究基金优先资助项目（H2013209192）；河北联合大学2013年大学生创新性实验计划项目（X2013064）

牛慧敏（1992-），大学本科。研究方向：药物新剂型与新技术。E-mail：416097671@qq.com

刘占军（1967-），大学副教授，硕士生导师。研究方向：药物新剂型与新技术。E-mail：liuzhanjun815@163.com