心血管疾病相关的循环miRNA的来源与存在形式及其功能

卜晓敏，王 锋综述，汪俊军审校

0 引 言

microRNA是一类长约19～23个核苷酸的内源性非编码单链小RNA分子，最早于20世纪90年代在秀丽隐杆线虫体内被发现，其序列、生成过程在进化上高度保守，对生命活动的调控至关重要［1-3］。miRNA通过与靶mRNA分子的3'非编码区域互补配对，抑制靶mRNA的翻译或者特异性地切割靶mRNA，从而实现对靶基因的调控［1，4］。大量研究表明，miRNA参与细胞周期，分化及代谢等多种细胞活动，在细胞的生理和病理活动中起着重要作用，与多种疾病的发生、发展密切相关，是疾病潜在的标志物和治疗靶点［2，5］。心血管疾病(cardiovascular disease，CVD)是全世界患病率和致死率最高的疾病之一，研究表明CVD患者，特别是早期患者具有特异变化的循环microRNA。有关CVD相关的循环miRNA的来源、稳定的存在形式及其功能的研究已引起广泛关注，本文就该领域的相关研究进展进行综述。

1 与心血管疾病相关的循环miRNA的来源

1.1 破裂细胞的被动渗漏 研究表明，miRNA可通过组织损伤和细胞破裂等被动渗漏方式释放入体液，并在体液中稳定存在［6-9］。CVD患者血清升高的miRNAs可能来源于心肌损伤以及动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)斑块的破裂。如miR-208是心肌组织特异的miRNA，在CVD患者血清/血浆中特异升高;miR-1、miR-133a和miR-499在心肌和骨骼肌中特异表达，可在心肌损伤和骨骼肌损伤(外科手术或剧烈运动)后释放入血［9］。Raitoharju等［10］研究发现，AS患者斑块中 miR-21，miR-34，miR-146a，miR-146b-5p和 miR-210水平显著升高。Scalbert等［11］发现AS斑块中与血管生成相关的微囊泡中miR106a，miR-25，miR92和 miR-21 均显著高，提示CVD患者血清升高的这些miRNAs可能来源于斑块的破裂。

1.2 细胞主动分泌 循环系统中的miRNA除可来源于细胞的被动渗漏外，还可来源于细胞的主动分泌，前者为游离 miRNA，后者为分泌 miRNA。如CVD患者血清升高的miR-126，可来源于内皮细胞的主动分泌，并通过影响邻近细胞的趋化因子CXCL-12的产生而发挥保护血管的作用［12］。AS患者血浆升高的miR-223可来源于血小板的主动分泌，miR-150可来源于单核细胞的分泌，参与AS的发生、发展，与 CVD 密切相关［13-15］。

2 循环miRNA的存在形式

2008年有学者发现miRNA可长期稳定存在于血循环中，能抵抗RNA酶降解，首次将miRNA的研究由胞内引向胞外［16-17］。分泌miRNA因具有一定的功能已成为胞外miRNA研究的又一热点，胞外miRNA的不同存在形式与miRNA的功能密切相关。

2.1 细胞外微囊泡包裹 细胞通过细胞外囊泡包裹并分泌出miRNA，使miRNA免受核酸酶的降解。目前发现的可作为miRNA囊泡的主要包括外泌体，脱落囊泡及凋亡小体。外泌体是一种由多泡体产生，通过胞吐释放，大小在30～100 nm 的囊泡［18］。脱落囊泡主要通过质膜向外出芽或分裂产生并释放，在心血管领域也被称为微粒，大小在100～1000 nm［19］。外泌体、脱落微泡两者合称为微囊泡(microvesicles，MV)。凋亡小体形成于凋亡的终末阶段，是最大的细胞外囊泡，直径约1～5μm，其内含有细胞器及细胞质内容物(蛋白质，DNA与RNA)［20-21］。在AS过程中凋亡小体可通过将miRNA从凋亡的内皮细胞运输至周围的细胞而传递生存或生长信号［12］。

2.2 与载酯蛋白结合 Vickers等［22］发现，血浆miRNA可与高密度脂蛋白(high density lipoprotein，HDL)结合，经HDL运载到达靶细胞，如与HDL结合的miR-223可进入肝细胞并调节胞内RhoB和Ephrin A1蛋白的表达，且高胆固醇患者血浆HDL结合的miRNA表达谱较正常人差异显著。Wagner等［23］进一步研究证实，miRNAs在血浆中的运输还可以通过低密度脂蛋白(low densith lipoprotein，LDL)来实现，如miR-155在LDL中的量远高于HDL。

2.3 与Ago2结合 Ago2是一种RNA诱导的沉默复合体的执行元件，在细胞中直接与miRNA结合并介导对mRNA的抑制［24］。最近的研究表明，在AS过程中伴随着内皮细胞的坏死与凋亡，血浆中来源于内皮细胞的miR-126一部分以凋亡小体的形式存在，一部分以与Ago2蛋白结合的形式存在［25］。与Ago2结合的miRNA可以稳定存在于血浆或血清中，提示Ago2可以使与其结合的miRNA免受血浆或血清中的核酸酶的降解。

3 分泌miRNA在心血管疾病中的功能

3.1 促进心血管疾病发生

3.1.1 促进内皮细胞凋亡、迁移 血小板通过与中性粒细胞、单核细胞及血管上皮细胞相互作用在AS、中风等疾病中起着重要作用。研究发现，在促血小板生成素或凝血酶的作用下，血小板中miR-233表达显著升高，并以MV的形式释放到血浆中。肠炎、肝炎、肾炎和AS患者血浆中血小板MV(P-MVs)的miR-223水平显著升高。血小板释放的miR-233可通过靶向胰岛素样生长因子1受体促进糖基化终产物诱导的人脐静脉内皮细胞的凋亡［13］。

血管内皮细胞损伤继发迁移是心血管疾病发生发展的重要因素。研究发现miRNA可以作用于内皮细胞促进其迁移。近期研究显示单核细胞(THP-1)来源的MV可进入人微血管内皮细胞-1并释放miR-150，miR-150水平的升高可有效地降低c-Myb蛋白的表达而增强内皮细胞的迁移。进一步研究显示，从AS患者血浆中分离出的MVs含有较高水平的miR-150，这些MVs比从健康人分离的MVs更能有效促进人微血管内皮细胞-1的迁移，提示分泌microRNA可以MV的形式进入内皮细胞促进其凋亡、迁移，诱导AS的发生，促进心血管疾病的发生［14］。

3.1.2 促进血管生成 血管生成存在于许多疾病的生理及病理发生过程中，如肿瘤、肥胖相关和AS性疾病［26］。体外的毛细血管形成实验和体内的血管生成实验结果显示，单核细胞分泌的含有miR-150的MV具有较强的促血管生成活性。AS患者血浆中升高的分泌型miR-150也可显著促进血管生成。通过MV形式给予荷瘤小鼠和ob/ob肥胖小鼠(瘦素缺陷型小鼠)miR-150的反义寡核苷酸，下调miR-150的表达可显著降低小鼠血管生成，在一定程度上抑制了AS的发展［27］。提示MV分泌的miR-150可促进血管生成，加速AS的发生，是心血管疾病潜在的治疗靶点。

3.1.3 促进心肌细胞肥大 心肌细胞肥大引起心力衰竭，Bang等［28］将心肌成纤维细胞与心肌细胞共培养发现，心肌成纤维细胞分泌的富含miR-21-3p(miR-21*)的MVs可进入心肌细胞并诱使心肌细胞肥大。在血管紧张素II诱导的心肌肥大的小鼠模型中，注入miR-21*抑制剂后发现肥大的心肌细胞病变明显减少。提示MVs包裹的miR-21*可释放进入心肌细胞，并促进心肌肥大，加速心血管疾病的发生。

3.2 心血管保护作用

3.2.1 抑制AS斑块形成 Hergenreider等［29］对在内皮细胞和血管平滑肌细胞间通讯的miRNA进行研究发现，内皮细胞中受Krupple样生长因子2调节显著升高的miR-143/145可进入平滑肌细胞抑制其靶基因表达;动物实验显示，将内皮细胞分泌的含有miR-143/145的微囊泡注入经高脂饮食喂养且主动脉ApoE基因缺陷(ApoE-/-)的小鼠体内后发现，其AS斑块形成明显减缓。综上所述，微囊泡介导的内皮细胞与平滑肌细胞间miRNA的传递在AS斑块的形成中发挥重要作用。

3.2.2 抗细胞凋亡 在缺氧等造成的动脉损伤的情况下，趋化因子12(CXCL12)可通过作用于其受体CXCR4招募骨髓中的祖细胞对血管进行修复，促进血管新生，抑制细胞凋亡。Zernecke等［12］发现人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cell，HUVEC)来源的凋亡小体可促血管平滑肌细胞、鼠主动脉内皮细胞中趋化因子12(CXCL12)的产生;同时发现miR-126是HUVEC来源的凋亡小体中含量最丰富的miRNA，可通过靶向调节多种蛋白如G蛋白信号16，进而调节CXCL12的表达;当给与AS模型小鼠凋亡小体或miR-126后发现，其可抑制AS斑块的形成，提示内皮细胞来源的凋亡小体包裹的miR-126具有抗细胞凋亡，抑制AS形成作用。间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSC)对于缺血性心脏病的治疗具有潜在的应用价值，其可通过分泌旁分泌因子保护缺血心肌。Feng等［30］研究发现缺血预处理后MSC分泌的外泌体富含miR-22，并可作用于心肌细胞，减少其因缺血造成的细胞凋亡;miR-22对心肌细胞的抗凋亡作用主要通过调节心肌细胞内甲基-CpG结合蛋白2的表达而实现。

3.2.3 抗炎作用 将内皮细胞与运载miR-223的HDL共孵育后发现内皮细胞中miR-223显著升高，而与miR-223缺陷的小鼠的HDL共孵育后内皮细胞中miR-223含量无显著变化，提示HDL运载的miR-223可进入内皮细胞。进一步研究发现HDL运载的miR-223可通过抑制内皮细胞内细胞间黏附因子1的表达发挥抗炎作用，进而可延缓心血管疾病的发生［31］。

3.2.4 心肌保护作用 心脏祖细胞(Cardiac progenitors，CPC)可通过旁分泌功能介导心肌保护作用。Chen等［32］研究了CPC来源的外泌体对急性缺血再灌注造成的心肌损伤的保护作用，发现CPC外泌体中富含miR-451，且可被心肌细胞(H9C2)摄取，通过抑制caspase 3/7的激活保护心肌细胞免受氧化应激造成的损伤，提示富含miR-451的CPC外泌体是潜在的心肌保护因子。

4 结 语

循环miRNA是潜在的疾病标志物已得到广泛认可，有关其稳定存在的形式、与疾病相关的来源与功能的研究已成为当前该领域研究的又一热点。研究发现，心血管疾病患者血浆特异性的miRNA可来源于损伤的心肌细胞、凋亡的内皮细胞以及AS斑块的破裂，并以MV包裹、HDL运载和Ago2蛋白结合等多种方式稳定的存在于血循环中，并被运输到内皮细胞等靶细胞，既可通过促进内皮细胞凋亡、迁移，促进血管生成和促进心肌细胞肥大而加速心血管疾病的发生，又可通过抑制斑块形成、抗细胞凋亡、抗炎、保护心肌细胞而保护心血管，共同调节心血管疾病的发生、发展。然而，尽管目前已取得了如上的一些进展，但与心血管疾病相关的循环miRNA的来源、存在形式及功能的研究仍处于探索阶段，其来源有待进一步发掘，稳定存在的不同形式与功能的关系尚不清楚，分泌miRNA对靶细胞的作用机制尚未完全阐明，其促进心血管疾病的发生和保护心血管作用哪种更占优势还有待证明［33］;且已有的研究大多集中在AS形成中对内皮细胞的作用，对心血管疾病的其他过程涉及较少，对AS行程中其他细胞的功能尚未可知;又如研究发现miR-122与核仁磷酸蛋白1(NPM1)共培养可保护miRNA免遭核酸酶的降解，但血液中是否存在miRNA-NPM1蛋白复合物还有待证实［34-35］。总之，进一步探明心血管疾病相关的循环miRNA的来源、存在形式及功能将为心血管疾病的诊断，预后评估及治疗提供新思路。

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