树突状细胞在肝细胞癌免疫治疗中的生物学特性及研究进展

刘杜菲(综述)，王正中(审校)

(重庆市大渡口区人民医院普外科，重庆 400084)



树突状细胞在肝细胞癌免疫治疗中的生物学特性及研究进展

刘杜菲※(综述)，王正中(审校)

(重庆市大渡口区人民医院普外科，重庆 400084)

树突状细胞(DC)是人体内一种专门承担抗原呈递功能的细胞，具备摄取并加工抗原的作用。高水平表达主要组织相容性复合物分子、共刺激分子、黏附分子和分泌高水平的细胞因子，有效激发T细胞免疫。DC是目前已知体内功能最强的抗原呈递细胞，在肝脏疾病的发生、发展中起着非常重要的作用。该文就DC的生物学特性、培养扩增、作用机制和DC免疫治疗原发性肝癌的新动态予以综述。

肝细胞癌；树突状细胞；免疫治疗

肝细胞癌占原发性肝癌的90%，是我国最常见的恶性肿瘤之一；其起病隐匿、发展快，大多数患者就诊时已是中晚期，且伴有不程度的肝硬化，手术切除率低，介入、放化疗等方法远期疗效不理想[1]。寻求一种合理有效的治疗中晚期肝癌新策略具有重要的现实意义和应用前景。伴随分子生物学、分子免疫学的研究进展，以免疫治疗为基石的生物疗法受到越来越多的关注，并逐渐成为治疗肝癌的重要手段。树突状细胞(dendritic cell,DC)是目前发现的功能最强的抗原呈递细胞，是天然免疫和适应性免疫连接的一个重要纽带，既能诱导初级免疫应答，又能诱导次级免疫反应，是启动、调节和保持免疫应答的关键环节[2]。当前，临床上的肝细胞癌免疫疗法发展迅速，并多以DC疫苗为基础，现就DC免疫治疗肝细胞癌的动态进行综述。

1 DC的生物学特性

DC是1973年美国科学家拉尔夫·斯坦曼在分析小鼠脾脏细胞时发现的，与常见的巨噬细胞不一样，这些细胞以表面存在一些类似树根样的“长突触”而得名。DC是一种字义性命名，具备标准的树杈样形态，主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex，MHC)Ⅰ、MHC-Ⅱ等类分子在膜表面呈高水平表达，能对淋巴器官及初始型T细胞产生刺激使其增殖活化，同时具有某些特异性抗原的细胞，均称为DC，该细胞广泛分布于脾脏、淋巴结、胸腺等淋巴器官以及皮肤、肝等非淋巴器官[3]。近几年研究发现，B细胞、T细胞和自然杀伤细胞共同的淋巴祖细胞及粒细胞、巨噬细胞、单核细胞等的共同髓系祖细胞均能在体内外分化为DC各类亚群；目前根据其来源和组织分布的不同，将DC分为5种亚群：浆细胞样DC、经典或组织局限性DC、迁移性DC、单核细胞来源DC和朗格汉斯细胞；当抗原或病原体进入机体，局部的DC可通过细胞表面的受体识别微生物糖原分子、核酸，感知病原体的入侵，起到免疫监视作用[4]。

2 DC的体外诱导培养

尽管DC在体内广泛分布于除脑及角膜中央部以外的组织器官中，然而其含量甚微，生理情况下半衰期为几天到几周，因此要通过直接提取的方法获得足量的用于研究或治疗的DC几乎是不可能的，需建立成熟的DC体外培养技术。长期以来，研究者完善了多种培养扩增DC的方法，均是应用不同的细胞因子进行诱导培养，其中常用的是人粒细胞巨噬细胞集落刺激生物因子(human granulocyte-macrophage colony stimulating factor,GM-CSF)、白细胞介素(interleukins，IL)10、IL-4、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)α、干扰素(interferon，IFN)γ、核因子κB寡核苷酸、脂多糖、转化生长因子(transforming growth factor，TGF)β等；GM-CSF是最基本、最重要的细胞因子，可诱导DC前体细胞扩增，促使其分化，并可在体外维持DC存活[5]。根据培养要求不同常在使用GM-CSF 的基础上联合其他细胞因子进行培养，如脂多糖、TNF-α、IFN-γ是常用的促DC成熟的细胞因子，而IL-4、IL-10、 TGF-β和核因子κB寡核苷酸则能抑制中性粒细胞、巨噬细胞等促炎性细胞因子产生，维持DC处于未成熟状态[6-7]。当用骨髓或脐血CD34+细胞作为前体时，则用TNF-α代替IL-4，因为TNF-α可降低粒细胞产生，上调细胞GM-CSF-β链的表达，增强其对细胞因子信号的反应能力[8]。目前，较为常用的方法是收集外周血单个核细胞重悬于无血清培养基中，37 ℃、5%CO2培养箱孵育2 h，去除非贴壁细胞，加入GM-CSF 1000 U/mL和IL-4 500 U/mL,刺激细胞向DC细胞分化[9]。根据生长情况，2～3 d进行一次半量换液，在第5日加入肿瘤抗原裂解物(50 mg/L)，刺激抗原特异性的DC产生；第6日加IL-1β、IL-6和TNF-α等细胞因子，刺激DC成熟；第7日检测细胞活力，应用流式细胞技术检测细胞表型CD11c、HLA-ABC、HLA-DR、CD40、CD80、CD83、CD86等的表达，成熟的DC高表达这些表面标记[10]。

3 DC的作用机制

DC是人体内一种专门承担抗原呈递功能的细胞，其主要是捕获、处理及呈递抗原，进而触发适度的免疫应答反应。不成熟的DC呈现C3b受体、免疫球蛋白Fc段受体、甘露糖受体及其他Toll样受体的高表达，低表达MHCⅠ/Ⅱ类分子，其捕获、处理抗原的作用较强，而呈递抗原并触发免疫应答的作用小[11]。成熟的DC则对MHCⅠ/Ⅱ类分子、CD40、CD80/86及CD1a、CD83分子产生高表达，其捕获、处理抗原的作用较弱，而呈递抗原并触发免疫应答的作用强，是人体抗肿瘤免疫反应的主要启动者和参与者[12]。DC具有多种免疫调节作用，可通过分泌不同类型的细胞因子影响适应性免疫应答的类型，并参与T细胞免疫耐受的形成；DC和T细胞相结合可产生大量IL-12、IL-18，刺激T细胞增殖，增加细胞毒性T淋巴细胞生成，刺激Th1型免疫应答，促进肿瘤细胞的清除；此外，还可通过触发穿孔素P颗粒酶B及FasL/Fas作用的途径加强自然杀伤细胞毒效应[13]。而DC分泌趋化因子则主要趋化初始型T细胞并诱导T细胞的聚集，使T细胞的保持效应在肿瘤生长部位长期作用，并可通过释放IL-12、IFN-γ等抗血管形成产物而抑制肿瘤血管的生成；同时趋化因子则以正反馈旁分泌的形式进一步活化DC，增加CD80、CD86与IL-12的表达，而DC也通过向CD8+T细胞提呈抗原肽促使CD8+T细胞的活化，CD4+与CD8+T细胞可同时进一步以直接杀伤和分泌细胞因子的方式，加强人体产生抗肿瘤的免疫应答[14]。

4 DC免疫治疗原发性肝细胞癌

肝癌组织及外周DC的数量减少和功能缺陷均可导致DC不能有效递呈抗原、激活T淋巴细胞、诱导抗肿瘤免疫反应，致使肿瘤浸润转移[15]。肝癌的免疫治疗需促进抗肿瘤效应细胞消灭肿瘤细胞，同时抑制抗肿瘤免疫调节机制，以DC为基础的免疫策略具有较强的抗肿瘤作用。

4.1 DC免疫治疗肝癌的基础研究 将肝癌细胞或组织的相关组分进行提取，或对肿瘤抗原进行提纯，再把提取物和DC一同培育，此时有效抗原可被DC捕获并递呈，以这种完成致敏的DC疫苗用于接种，可产生特异性较高的免疫反应。Tatsumi等[16]将致敏DC直接对CMS4肝癌荷瘤小鼠进行肝脏注射，观察到荷瘤小鼠肿瘤彻底消失，并使生存期明显延长。Chen等[17]通过BCGHSP70活化DC以提高DC的抗原递呈功能，从而利于DC将所携带的抗原有效地递呈给T细胞。王建等[18]发现，DC-Walker-256融合的肿瘤疫苗在大鼠肝癌模型中能诱导CD8+细胞毒性T淋巴细胞建立有效的抗肿瘤免疫，同时下调血管内皮生长因子和血管生成素2的水平，抑制肿瘤血管新生，从而达到治疗肿瘤的目的。杜文贞和于天霞[19]在用甲胎蛋白基因的重组腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus，rAAV-AFP)转导人DC体外诱导抗肝癌免疫应答中发现，AAV-AFP转导的DC高表达人类MHC-Ⅰ类分子(HLAⅠ,97.12%)、HLAⅡ(97.32%)、CD80(38.94%)、CD83(60.84%)、CD86(98.14%)等DC的典型表面标记；AAV-AFP转导后，81.2%的DC表达甲胎蛋白,AAV-AFP+DC能有效地刺激自体T细胞增殖、活化；激活后19.84%的CD4+T细胞和18.65%的CD8+T细胞能分泌IFN-γ而不分泌IL-4,对甲胎蛋白阳性的肝癌细胞系HepG2、BEL7402杀伤率分别为56.45%和78.94%；因此认为，AAV-AFP+DC体外能诱导出有效的抗甲胎蛋白阳性肝癌免疫应答。

4.2 DC免疫治疗肝细胞癌的临床效果 Shimoda等[20]用DC负载的天冬氨酸-β-羟化酶瘤苗免疫疗法能抑制肝细胞癌的发生，亦能减缓移植瘤生长；从健康人及肝癌患者提取的外周血单个核细胞制备的DC-天冬氨酸-β-羟化酶肝癌疫苗能强烈刺激抗原特异性的CD4+T细胞免疫，减少肝细胞肝癌复发。Nakamoto和Kaneko[21]也发现，以DC为基础的免疫靶向治疗能降低肝癌复发率。Bray等[22]发现，给肝癌患者注射肽负载的DC疫苗能增强自然杀伤细胞活性，降低调节性T细胞出现的频率。Palmer等[23]用HepG2肝癌细胞系致敏肝癌患者DC,对35例晚期肝癌患者进行Ⅱ期临床试验，取得了较好的临床效果，疾病控制率达28%，约50%患者甲胎蛋白水平下降，其中4例患者甲胎蛋白水平下降达70%。肝癌细胞相关组分致敏的DC疫苗可于肝癌患者体内激发特异性抗肿瘤免疫反应，在患者体内建立肿瘤特异性的、持久的免疫应答，取得了一定的临床效果，且无明显的不良反应[24]。Nakamoto等[25]对13例肝动脉栓塞治疗后的肝癌患者注射链球菌源性抗肿瘤免疫治疗剂OK432刺激后的DC疫苗，结果显示，其无复发且存活率较对照组高。

5 小 结

DC是机体功能最强的专职抗原递呈细胞,其能高效摄取、加工处理和递呈抗原，处于启动、调控、并维持免疫应答的中心环节。以DC为基础的肝癌免疫治疗是当前的研究热点，已经在肝癌患者中显示出较强的抗肝癌免疫活性和初步临床疗效，对于改善肝癌患者生活质量、降低复发率有着非常重要的意义。但DC的制备、临床应用都欠缺规范化管理，而且DC与肝癌发生、发展、转移、复发的确切机制尚不清楚。相信随着肝癌免疫治疗基础研究的不断深入和分子免疫学、生物学的发展，肝癌的DC免疫治疗将会更加合理，更有前景。参考文献

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Biological Characteristics and Research Progress of Dendritic Cells in Immunotherapy for Hepatocellular Carcinoma

LIUDu-fei，WANGZheng-zhong.

(DepartmentofGeneralSurgery,ChongqingDadukouDistrictPeople′sHospital,Chongqing400084，China)

Dendritic cell(DC) is a kind of antigen-presenting cells in human body.It uptakes and delivers antigen.High-level expression of major histocompatibility complex molecules,costimulatory molecules,adhesion molecules and high-level secretion of cytokines can stimulate T cell immunity.DC has been known as the most powerful antigen-presenting cell in human body,it plays an important role in the incidence and development of liver diseases.Here is to make a review of the latest research progress on DC,include the biological characteristics,culturing,mechanism of action,and the DC immunotherapy for hepatocellular carcinoma.

Hepatocellular carcinoma； Dendritic cell； Immunotherapy

R392.1

A

1006-2084(2015)12-2177-03

10.3969/j.issn.1006-2084.2015.12.024

2014-07-10

2014-10-13 编辑：郑雪