哺乳动物胚胎体外培养的研究进展

丁 芳(综述)，周红林(审校)

(1.三峡大学仁和医院妇产科，湖北 宜昌 443001； 2.昆明医学院第二附属医院妇科，昆明 650101)



哺乳动物胚胎体外培养的研究进展

丁 芳1※(综述)，周红林2(审校)

(1.三峡大学仁和医院妇产科，湖北 宜昌 443001； 2.昆明医学院第二附属医院妇科，昆明 650101)

葡萄糖对卵裂阶段胚胎的发育有抑制作用，但早期胚胎体外发育中添加葡萄糖并不是完全不必要的，8-细胞前需要非必需氨基酸，8-细胞及以后利用所有氨基酸。低浓度必需氨基酸促进胚胎发育，高浓度必需氨基酸抑制胚胎发育。牛血清白蛋白等大分子物质既能供给胚胎营养，促进细胞生长、增殖与分裂，又能消除血清的不利影响，是很好的蛋白质替代品，一些生长因子对胚胎发育起积极作用。共培养及序贯培养虽可以改善胚胎发育状况，但也存在一些负面影响。

哺乳动物；胚胎；体外培养

哺乳动物早期胚胎的体外培养已经历了半个多世纪的发展，大量的实验室研究主要集中在培养液优化上，对于培养液的优化主要体现在两个方面：一种是改进化学成分明确的培养液，如在化学成分明确的培养液中适当减除、替代或添加某些组分来改进培养液，因此需要掌握简单培养液中的基本成分有哪些及各自的作用是什么，这样才有利于对处理因素的观察分析，有利于探讨早期胚胎的发育机制；另一种采用体细胞与胚胎共同培养，或将胚胎在不同发育阶段放入不同培养液中进行序贯培养等，其目的在于提高哺乳胚胎的体外发育率、种植率及妊娠率。该文旨在研究哺乳动物胚胎最佳体外培养条件，以期体外培养胚胎更接近体内自然状态，从而进一步推动生命科学相关学科的发展。

1 培养液及其发展

自1956年Whitten[1]成功实现小鼠胚胎体外的培养以来，培养基经历了无数次的更新与发展，如早期的简单培养液、Brinster′s培养液、修正的Whitten′s培养液、M16、MTF和HTF培养液等，这些培养液虽然在一些品系的小鼠上取得成功，但遇到一个共同的难题，即“2-细胞阻滞”现象。Chatot等[2-3]发明了CZB培养液，同时用该培养液培养小鼠胚胎，使部分品系的小鼠突破了2-细胞阻滞现象，发育到囊胚。随后，Lawitts和Biggers[4]设计了KSOM培养液，增加更多品系小鼠胚胎的囊胚发育率。复合培养液同样经历了无数次的改进，最早的复合培养液有20世纪50年代设计的Ham′sF10、TCM199，随后80年Keefer等[5]发现了BME和Ham′sF10(1∶1)的混合培养液，证实该培养液更利于兔胚胎的体外发育。后来，Jin等[6]发现了RDH(RPMI1640/DMEM/Ham′s F10 1∶1∶1)和RD(RPMI1640/DMEM 1∶1)的混合培养液，同时体外培养囊胚成功并获得仔兔。每一次发现都在不同程度上改善了哺乳动物胚胎的体外发育率，都是生命科学史上里程碑的一次突破。

2 培养液主要成分

2.1 能量底物 哺乳动物输卵管液和子宫液中的主要能量底物有丙酮酸、乳酸及葡萄糖，不同物种的生殖道中，这3种能量底物的浓度各不相同。研究证实，哺乳动物早期胚胎卵裂阶段的主要供能物质是丙酮酸和乳酸，葡萄糖对卵裂阶段胚胎的发育有抑制作用，致密化期以后主要利用葡萄糖供能。然而，近年来研究表明，葡萄糖对绵羊、猪的植入前胚胎的体外发育无抑制作用[7]。有研究发现，一种含有恒定浓度4.7 mmol/L 葡萄糖的复杂培养液，能完全支持人类受精卵发育到囊胚阶段[8]。生理状态下哺乳动物输卵管和子宫液中能检测到葡葡糖的存在，由此可以推测，早期胚胎体外培养液中葡萄糖的添加并不是完全不必要的，葡萄糖在早期胚胎体外发育中具体的作用时间及作用机制目前尚不完全清楚。

2.2 氨基酸 自1990年国外研究者首次发现了氨基酸在小鼠胚胎体外培养中的作用以来，人们对氨基酸进行了反复的研究，Eagle将氨基酸分为必需氨基酸和非必需氨基酸，在2-细胞阶段添加非必需氨基酸和谷氨酸能提高小鼠囊胚形成率、细胞数、孵化率和移植后发育潜力[9-10]。非必需氨基酸还能促进8～16细胞到囊胚阶段哺乳动物胚胎发育[11]，8-细胞前添加必需氨基酸抑制囊胚的发育[4]，8-细胞阶段添加必需氨基酸却能促进内细胞团的发育和随后胎儿的发育[12]，低浓度的必需氨基酸对水牛体外受精-胚胎移植的胚胎的发育具有一定促进作用,但高浓度则有抑制作用[13]。必需氨基酸的浓度降到半浓度时，能提高小鼠植入前胚胎的体外发育[14]。有研究发现，高浓度的必需氨基酸代谢和自由降解中会产生对胚胎有毒性的铵。当以1 mmol/L的谷氨酰胺衍生物丙氨酰基-谷氨酰胺替代谷氨酰胺时，可以显著降低铵的生成[14]。同时添加必需和非必需氨基酸到MSOM培养液中，浓度为Eagle′s培养液一半时，能支持小鼠受精卵发育到囊胚后期，而且能促进内细胞团的增殖[15]。

2.3 蛋白质和大分子物质 有研究发现，血清能提高早期胚胎体外发育的囊胚率[16]，培养系统中血清成分的缺乏会影响胚胎表面微绒毛的发育。胎牛血清可以促进猪孤雌胚胎的早期体外发育[17]。添加混合血清能促进水牛胚胎体外发育[18]。牛血清白蛋白对山羊体外受精卵具有明显促卵裂作用[19]。胰岛素样生长因子2、胰岛素能增加体外培养的囊胚细胞数[20]，表皮生长因子及胰岛素样生长因子2对体外培养鼠胚的发育有协同促进作用[21]。0.1 μg/L胰岛素样生长因子2和表皮生长因子作为胚胎培养浓度较佳[22]。白细胞抑制因子促进2～8细胞胚胎发育至桑椹胚，同时也能促进桑椹胚向扩大囊胚和孵化囊胚发育，白细胞介素1β、白细胞介素2、白细胞介素6及干扰素γ对绵羊早期胚胎的发育无显著影响[23]。

3 培养体系的改进

3.1 共培养 国外有研究证实不合适的培养体系可以导致胚胎发育异常，20世纪80年代末期，研究者们研究出一种新型的培养技术——细胞共培养技术，细胞共培养是将2种或2种以上的细胞共同培养于同一环境中，共培养能使细胞间相互沟通信息，相互支撑生长增殖，能更真实地模拟体内环境。国内研究者认为共培养体系主要有以下优点：诱导细胞向另一种细胞分化、诱导细胞自身的分化、维持细胞的功能和活力、对细胞增殖进行调控、促进早期胚胎的发育和提高代谢物的产量。有学者采用人卵丘细胞、昆明鼠卵丘细胞、昆明鼠成纤维细胞分别与昆明鼠2细胞期胚胎共培养，发现不同类型的体细胞共培养体系均可在体外为胚胎发育提供一种更类似于体内的环境，有利于胚胎在体外发育[24]。含有小鼠输卵管上皮细胞+垂体细胞的CZB培养液可有效促进小鼠孤雌胚胎突破2细胞阻滞[25]。在体外环境下,牛体外胚胎与子宫内膜细胞共培养后能正常孵化[26]。共培养能显著提高2-细胞发育率、降低胚胎内部H2O2水平，提高4-细胞率及降低胚胎内部H2O2水平[27]。

3.2 序贯培养与序贯共培养 与胚胎培养全程在同一培养液中进行远不能满足胚胎对营养物质的需求，鉴于这一理论，人们提出了序贯培养，常用的序贯培养液有用于人胚胎培养G1/G2。刘军等[28]研究证实，与传统的培养液相比，序贯培养液G1/G2能更好地支持山羊核移植胚胎的发育。G1/G2支持绵羊、牛和猪的体外受精胚胎发育的报道也屡见不鲜。国内有研究发现，SOF培养液和颗粒细胞+添加胎牛血清的NCSU-23 输卵管上皮细胞的序贯培养系统能较好地促进胚胎的发育。后来，有学者又将序贯培养和共培养联合起来对胚胎进行体外培养，发现序贯联合子宫内膜细胞共培养的方法与单纯的体外序贯培养相比，其囊胚形成率更高，是进行废胚继续体外培养的更有效方法[29]。冷冻胚胎经序贯共培养能改善胚胎发育潜能，子宫内膜细胞共培养联合序贯成组培养对人早期冷冻时限较长的胚胎发育具有积极的支持作用[30-31]。

4 小 结

哺乳动物着床前胚胎培养是一个不断发展的领域，目前的培养基及培养体系尚需进一步完善，以期体外培养环境与体内环境最接近，但由于脱离母体环境，胚胎的发育率及质量仍有很多问题。如体外发育过程中暂时结构正常，随后可能出现基因分化、染色体变异等，这可能是细胞凋亡、胚胎流产、死亡的重要原因，因此，培养基及培养体系的改进是一个值得长期深入研究的课题。

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Research Progress in Mammalian Embryos Cultured in Vitro

DINGFang1，ZHOUHong-lin2.

(1.DepartmentofGynecologyandObstetrics,RenheHospitalofThreeGorgesUniversity,Yichang443001，China; 2.DepartmentofGynecology,the2ndAffiliatedHospitalofKunmingMedicalCollege,Kunming650101,China)

Glucose has inhibitory effect on embryos development in cleavage stage,but it is unnecessary to add glucose in early embryos development in vitro,embryos before stage of 8-cells need non-essential amino acid,embryos of and after stage of 8-cells need all amino acids.Low concentration of essential amino acids can promote the embryonic development,while high concentration of essential amino acids inhibit embryonic development.Bovine serum albumin and other macromolecules can supply nutrition to the embryos,as well as promote cell growth,proliferation,differentiation,and eliminate the adverse effects of serum,which makes them very good protein substitutes.Many growth factors also have positive effects on embryonic development.Coculture and sequential culture can improve the status of embryonic development,although there are also some negative effects.

Mammals; Embryo; Culture in vitro

S814.8

A

1006-2084(2015)12-2166-03

10.3969/j.issn.1006-2084.2015.12.020

2013-08-30

2014-11-03 编辑：伊姗