皮肤结核诊断的新进展

白 洁，张全华，颉玉胜(综述)，赵红斌(审校)

(兰州军区兰州总医院安宁分院 a.检验科，b.皮肤美容科，兰州730070)

据世界卫生组织统计，结核分枝杆菌(简称结核杆菌)每年引起全球约300万人死亡［1］。随着结核病呈流行性趋势，皮肤结核(非肺性结核)也呈上升趋势。不断出现的耐药结、耐多药结核病，使有效控制结核病面临更大的挑战［2］。皮肤结核早期一般无症状，临床表现多样性，且与有些皮肤病表现相似，易造成误诊。实现对皮肤结核(非肺性结核)的有效诊断迫在眉睫。现皮肤结核杆菌的细菌学检测和免疫学检测，分子生物学检测等方面进行综述。

1 皮肤结核病的传统诊断方法缺点

1.1 细菌学诊断 常规的细菌学诊断包括直接涂片抗酸染色和常规的细菌培养法。抗酸染色是最基本的检测结核杆菌的方法［3］。由于皮肤标本中［活组织检查(活检)，脓液中］含菌量很小，所以阳性率很低。如果是非结核杆菌感染的皮肤结核则没办法检测出结果。其次，细菌常规培养时间长，周期慢，要求高，通常需要2～3个月才能出结果而且培养出的结果阴性居多，从而影响结果的判读。另外，与常规的结核杆菌细菌培养比［4］，非结核杆菌的检测及鉴定通常操作要求更复杂。

1.2 免疫学诊断

1.2.1 结核菌素皮肤试验 结核菌素皮肤试验作为一项辅助诊断判断机体是否感染结核杆菌，但此方法无法确定出是新感染的结核还是过去感染的结核杆菌，因此有一定的局限性［5-6］。

1.2.2 酶联免疫吸附法 酶联免疫吸附法可以检测患者血清中结核特异性抗体，此方法无需特殊仪器而且能快速诊断出结核杆菌，所以在结核病血清学诊断方面研究最多也最广［7-9］。近年来免疫层析法、蛋白印迹和免疫斑点法均对皮肤结核的诊断发挥重要的作用，尤其是免疫斑点法对皮肤结核的脓液、分泌物的检测更为有效、快速。但观察对象不同，检测使用抗原不同，质量控制困难，人员操作等因素影响试验结果［10］。

1.3 病理组织学检查 结核杆菌皮肤感染常有典型的病理学特点，如朗格汉斯巨细胞，淋巴细胞为主形成的结核结节，中央有干酪样坏死区域［10］。但由于非结核杆菌毒力较弱，中性粒细胞浸润，嗜酸粒细胞增多，可发生非干酪坏死性组织细胞的反应，有的甚至不发生类上皮细胞反应［11］。另外，皮肤结核活检的标本小，有些结核发生于面部，颈部不容易取材观察。

2 新型皮肤结核诊断的方法

2.1 分子生物学诊断方法 近几年，随着分子生物学技术的飞速发展，结核杆菌分子分类鉴定方法也逐渐建立并完善起来。目前用于检测皮肤结核的方法有聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)，核酸杂交，基因芯片等技术。

2.1.1 实时荧光定量PCR 实时荧光定量PCR检测，具有高特异性、高敏感性、快速简便等特点。结核杆菌易受物理、化学、药物及免疫因素的影响而发生变异(细胞壁缺陷或称L型菌、耐药变异菌、持续菌或休眠菌等)，用传统细菌学技术难以检出，造成漏诊和假阴性。PCR方法检测对象是结核杆菌基因保守区段不受细胞表型和耐药等因素的影响，可提高阳性的检出率。丘疹坏死性结核用传统方法通常在其皮损中查不到结核杆菌，文献报道，在上述病例中丘疹坏死性结核疹中用PCR检测到结核杆菌，这为皮肤结核的诊断提供可靠的依据［12］。荧光定量PCR是一种准确、快速、敏感性高、特异性好的方法，尤其对包埋的标本和组织蜡块的检测更为有效。弓显凤等［13］检测15例临床与病理上诊断为皮肤结核的石蜡包埋活检标本，结果8例检出结核杆菌复合群，比直接镜检与培养法所得的阳性率要高得多。李晓非等［14］应用实时荧光定量PCR法用于结核病诊断，其特异性和敏感性均有所提高，显著高于涂片，且操作简便，对于结核病尤其是肺外结核的诊断具有较高的应用价值。陈淑云和采云［15］报道用荧光定量PCR，敏感性要比一般PCR高，菌阳性寻常型狼疮结核分泌物中阳性率为93.7%，在菌阴性寻常型狼疮中为28.6%，而一般PCR在菌阴性的寻常型狼疮中阳性率仅为24.8%。

2.1.2 核酸分子杂交 Posteraro等［16］将扩增的16SrRNA13种探针进行杂交，再与抗生蛋白链菌素-碱性磷酸酶共同孵育一段时间后加入相应底物，已杂交的产物即可显色。用这种方法检测从镜检及培养均为阴性的寻常狼疮患者皮损中检测到结核杆菌DNA，证实此技术的可靠性和更高的敏感性。

2.1.3 基因芯片技术 近年来，随着分子生物学技术的飞速发展，基因芯片技术已初步应用于结核杆菌的实验室诊断。基因芯片技术是针对不同的基因突变型，将核酸探针固定在载体上，同时用PCR技术进行特异性扩增，并将扩增片段与基因芯片进行杂交。最后芯片扫描成像，用配套软件进行判读，可以在6～8 h内得出鉴定结果，从而解决了传统核酸印迹技术的操作繁琐、自动化程度低、操作序列数量少、检测效率低等缺点。张立群等［17］试验的新型基因芯片技术，基因芯片集芯片技术与PCR技术为一体，具有较好的敏感性和特异性，而且芯片背景干净清晰，可以快速检测17种临床常见分枝杆菌，将常规的检测时间由6～8周缩短为6 h。与传统方法相比，此法有效地解决了传统基因芯片应用过程中，需要大型检测设备不便于临床应用推广的瓶颈问题，但成本高［18］。

2.2 结核杆菌特异性细胞免疫反应检测 结核杆菌特异性细胞免疫反应检测作为新的体外细胞免疫检测的手段，因其不受卡介苗接种后的交叉反应，以及不受绝大多数非结核杆菌的影响，主要用于结核的诊断［19］，其灵敏度和特异度可以达到90%以上;结核杆菌特异性细胞免疫反应检测释放试验利用结核杆菌而非牛分枝杆菌BCG株系表达的抗原刺激外周血单核产生γ干扰素，用于结核杆菌潜伏感染或活动感染的辅助诊断，经体外全血培养，刺激全血标本中结核抗原特异性T细胞产生的免疫应答，从而提供一种结核杆菌感染T细胞检测方法。检测结果在血样采集后12～18 h得出，报告结果分为阳性、阴性和不确定。与目前我国广泛使用结核菌素皮肤试验皮试比较，结核杆菌特异性细胞免疫反应检测在发现结核菌感染的敏感性方面更有优势，不仅如此，相比结核菌素皮肤试验的诊断方面敏感性更高［20］。此外，由于结核杆菌特异性细胞免疫反应检测不存在无法留取痰标本的问题，这对于一些无法留取痰标本的患者，尤其是肺外结核的辅助诊断具有较重要的实践意义。

世界上1/3的人口都存在潜伏性结核杆菌的感染［21］。近年来，大量实验结果表明结核杆菌特异性细胞免疫反应检测与结核菌素皮肤试验相比较，结核杆菌特异性细胞免疫反应检测具有较高的特异性。对于潜伏感染结核杆菌特异性细胞免疫反应检测的特异度在90%以上，结核杆菌特异性细胞免疫反应检测对于判断皮肤结核是否存在结核潜伏感染的结果比结核菌素皮肤试验更准确［22-23］。

3 结语

运用新型、高效的技术及合理的诊断方案来诊断皮肤结核，成为皮肤结核病研究的主要课题。对皮肤结核诊断的新方案还有待于进一步研究。在诊断与治疗皮肤结核杆菌感染时把传统方法与分子分类鉴定方法相结合，综合考虑各种检测结果，可为皮肤结核杆菌感染的早期诊断与治疗提供可靠依据。

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