包涵体蛋白复性的研究进展

付明娟，林接玉(综述)，谢捷明(审校)

(1.福建医科大学药学院药理学系，福州 350004； 2.福建医科大学附属协和医院药学部，福州 350001)



包涵体蛋白复性的研究进展

付明娟1△，林接玉1,2(综述)，谢捷明1※(审校)

(1.福建医科大学药学院药理学系，福州 350004； 2.福建医科大学附属协和医院药学部，福州 350001)

摘要：包涵体是指外源重组蛋白在细胞内凝集的无活性的固体颗粒。经分离、洗涤除去一些膜蛋白或膜碎片后，用适宜试剂溶解,如高pH值加低浓度的尿素缓冲液、不同羟基的醇类或含小分子的变性剂。传统的稀释、透析等复性方法效率一般较低，目前可通过高静水压、沸石的高通量筛选及高通量筛选结合实验设计软件的方法提高复性效率。希望可以找到一种适于所有重组蛋白的高效、简便的复性方法，实现不易获得的外源重组蛋白简易的规模化生产。

关键词:包涵体；蛋白质；复性

目前，以基因工程药物为主导的基因工程应用产业已成为全球发展最快的产业之一，具有非常广阔的发展前景。大肠埃希菌因易于操作、遗传背景清楚、生产成本低及表达水平高而被广泛应用于重组蛋白质的获取。因大肠埃希菌体内缺重组蛋白正确折叠的适宜条件而形成聚集体，即包涵体[1]，尽管其具有不易被菌体内蛋白酶分解、表达量多等优点，但如何将无生物活性、错误折叠的不溶蛋白转变成有活性的可溶蛋白这一难题仍困扰着人们，而且其复性效率一般较低，L-精氨酸等促进复性物质的应用及沸石的高通量筛选等新的复性方法的建立都极大地增加了包涵体蛋白复性产率[2]。现就包涵体的溶解、复性方法及如何提高蛋白复性产率进行综述，以期找到一种适于所有包涵体的复性方法。

1包涵体

1.1包涵体的定义与特性包涵体是指重组蛋白在大肠埃希菌体内大量集聚形成的一种明显不同于细胞质中的其他成分。其一般包含大部分既无天然结构又无活性的重组蛋白，还有少量菌体蛋白等物质，呈无定形状态[3]，密度较大，一般难溶于水，但可溶于含有促溶剂，如L-精氨酸的变性剂尿素、盐酸胍等。核磁共振等新技术的应用证明了包涵体可通过适宜的方法使其复性从而获得生物活性[4]。

1.2包涵体的制备

1.2.1分离含重组蛋白基因的大肠埃希菌先扩大培养、诱导表达，然后离心弃上清即可获得大量菌体，其可通过超声破碎[5]或化学方法，如溶菌酶裂解分离出包涵体，其中前一种方法获得的包涵体含杂质较多，不易纯化，若两种方法结合可以获得纯度较高的包涵体。

1.2.2洗涤为除去包涵体上黏附的杂质，如一些膜碎片和膜蛋白等，包涵体通常用低浓度的变性剂洗涤。

1.2.3溶解去垢剂或变性剂是一般常用的包涵体溶解剂，常用的去垢剂(如十二烷基硫酸钠、十二烷基肌氨酸等)可破坏蛋白内的疏水键，溶解包涵体。常用的变性剂有6～8 mol/L的尿素或盐酸胍，可破坏蛋白间的氢键，使蛋白增溶。对人重组粒细胞刺激因子包涵体蛋白溶解和复性的研究发现，碱性(pH值约为10)环境能有效溶解该蛋白，低浓度的尿素具有协同作用，且此法更有利于蛋白的复性[6]。近几年，含有不同羟基醇类的变性剂对人类生长激素包涵体蛋白溶解的研究认为，6 mol/L正丙醇加2 mol/L尿素的溶解效果最好。虽然此条件溶解的蛋白量比用强变性剂溶解的蛋白量少，但此法溶解的蛋白复性产率较后两者高[7]。另外，有报道，在3.5 mol/L 盐酸胍变性液中加入8 mmol/L半胱氨酸可有效溶解包涵体且极大地提高了其后续蛋白复性产率[8]。

2包涵体的复性

因包涵体不具有重组蛋白天然的空间结构从而失去了生物活性，故需要采用适宜的复性方法使重组蛋白进行正确的重折叠，重新获得生物活性。

2.1包涵体蛋白复性方法

2.1.1稀释复性目前稀释复性是生物制药学中最简单、使用最广泛的一种复性方法，为减少重组蛋白的聚集、增加其复性率，宜采用低浓度的重组蛋白在大的搅拌槽中进行复性。影响因素很多，如pH等[9]。此法已成功用于α乳清蛋白的复性[10]。

2.1.2超滤复性超滤复性易于对复性过程进行控制，较多地应用于大规模生产中，通过适宜的装置借助离心力除去变性剂而实现重组蛋白的复性，但离心力过大可能会使重组蛋白永久性复性。

2.1.3透析复性透析复性通过缓慢降低变性剂浓度使蛋白复性，此过程消耗时间长，不适于规模化生产，但可以保持蛋白体积不变，如成纤维生长因子8已用此法成功实现复性[11]。

2.1.4液相色谱复性目前液相色谱复性在生产中已成功应用，如疏水相互作用色谱[12]、离子交换色谱[6]、凝胶排阻色谱[13]、亲和色谱[14]。包涵体蛋白变性后在色谱柱上复性，其复性回收率高、快速、易放大，样品稀释倍数小。

2.1.5反胶束复性法该法[15]利用表面活性剂分子在有机溶剂中自发形成的反相胶团为包涵体蛋白复性提供适宜的环境。在一定条件下将水溶性蛋白质分子增溶进反胶团的极性核中，再创造条件将蛋白质抽提至另一水相，实现蛋白质的相转移，达到分离的目的。

2.1.6双水相复性法双水相系统通常是由水溶性的两种聚合物组成或一种水溶性聚合物与一种盐组成。与一般分离纯化技术相比，双水相技术具有处理容量大、能耗低、活性损失小、分离步骤少、易连续化操作和工程放大等优点，在蛋白质、酶、核酸等生物大分子的分离纯化等方面受到广泛重视，是一种有发展潜力的易于工业化应用的生物分离技术。此方法已成功用于金黄色葡萄球菌生长因子G的复性[16]。

2.2影响包涵体蛋白复性的因素包涵体重组蛋白的复性是一个非常复杂的过程，既与包涵体自身形成的原因有关，又需要其正确折叠的外部环境。

2.2.1复性初始浓度包涵体重组蛋白的复性产率与其正确折叠速度和聚集速度的相对大小有关，低浓度的重组蛋白可以减少其分子间相互碰撞而聚集沉淀从而显著提高重组蛋白的复性效率[17]。操作过程中可采用磁力搅拌使重组蛋白在其复性全程中处于低浓度状态。

2.2.2pH值复性过程中最佳的pH不但可以防止与重组蛋白的等电点重合而聚集，又可以避免重组蛋白中自由基的质子化而使其永久性变性，从而大大提高了蛋白质的复性产率。

另外，影响蛋白质复性的因素有高静水压[18]、蛋白复性容器、包涵体溶解剂等。

2.3促进包涵体蛋白复性的方法

2.3.1高浓度的蛋白复性一种简易的高产率复性方法可采用高浓度的重组蛋白进行复性，如把高浓度的重组蛋白在不断搅拌的条件下，缓慢的分阶段的加入到稀释缓冲液中，如Chen和Leong[19]采用脉冲式pulsed fed SEC(SEC)，使α胎球蛋白的复性浓度大大提高，进而实现其高效率的复性；在高流体静水压的条件下复性[20]；通过控制复性过程中的温度：先低温后高温，减少重组蛋白的聚集体的生成，提高其复性产率。

2.3.2添加促进剂的复性方法常用促进剂如下。①共溶剂：可降低重组蛋白的聚集沉淀而提高其复性产率，如聚乙二醇6000～20 000 )[21]。②去污剂[22]或表面活性剂：可增加包涵体重组蛋白的稳定性，如rition X-100等可促进重组蛋白的复性。③氧化-还原剂：适宜的氧化还原环境可提高含二硫键的包涵体重组蛋白的复性效率，如在复性过程中加入谷胱甘肽(氧化型/还原型)、二硫苏糖醇/谷胱甘肽还原型[23]、二硫赤藓醇/谷胱甘肽还原型等氧化还原对。④低分子添加剂：如人鸟苷三磷酸酶活化蛋白[24]、L-精氨酸[25]等，其可通过稳定包涵体重组蛋白中间体的稳定性促进其复性。⑤重组蛋白折叠酶[26]：如硫氧还蛋白二硫键异构酶、FK506结合蛋白、亲环蛋白等可降低包涵体重组蛋白的错误折叠，增加其正确折叠而提高复性产率。⑥人工伴侣：可降低重组蛋白中间体聚集沉淀而促进其复性，如xynB64在复性过程中加入环糊精提高其正确折叠率[27]。

2.3.3其他提高复性产率的策略还有许多，如多壁碳纳米管复性，其已成功用于木聚糖酶的复性过程中[28]。已有研究发现，利用沸石[29]的高通量筛选进行蛋白复性，因为沸石是一种多孔的晶状铝硅酸盐，不同的SiO2/Al2O3比例表现出不同的离子交换特性和疏水性，它最大的优点是在高浓度盐存在的情况下，蛋白也可以被很好地吸附。最近，有研究报道，将高通量复性筛选和实验设计软件相结合的两步复性条件筛选，此法需要蛋白量低、但耗时短[30]。

3展望

包涵体复性的瓶颈是提高蛋白浓度和生物活性，近年来人们在这方面做了很多研究，但至今没有一种复性方法适于所有包涵体蛋白，故需人们对其做更深一步的探索研究。最近Lu和Lin[31]发现有活性的包涵体存在；Sans 等[32]通过优化表达岩藻糖苷酶的培养条件获得了具有生物活性的包涵体，并且其生物活性比用传统培养条件获得的可溶性蛋白的生物活性更高。虽然包涵体蛋白研究还处在初级阶段，但其潜力巨大，不容忽视。

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The Research Progress of Inclusion Body Protein RenaturationFUMing-juan1,LINJie-yu1,2,XIEJie-ming1.(1.DepartmentofPharmacology,FujianMedicalUniversityPharmacyCollege,Fuzhou350004,China; 2.DepartmentofPharmacy,UnionHospitalAffiliatedtoFujianMedicalUniversity,Fuzhou350001,China)

Abstract:Inclusion bodies are the inactive solid particles agglutinating by exogenous recombinant protein in cells.After separation and washing to remove some pieces of membrane proteins or film,they can be dissolved by appropriate reagent,for example the buffer with high pH value and low concentration of urea,alcohol with different hydroxyl or denaturant containing small molecule.The renaturation efficiency traditional renaturation method such as dilution,dialysis is generally low.At present,we can improve refolding efficiency through high pressure,high throughput screening of zeolite and high-throughput screening combined with experimental design software.We wish to find an efficient renaturation method suitable for all recombinant proteins,so as to realize large-scale production of recombinant proteins which are difficult to obtain.

Key words:Inclusion body； Protein； Renaturation

收稿日期：2014-12-08修回日期：2015-04-28编辑：相丹峰

基金项目：国家自然科学基金 (30772587)；福建省自然科学基金 (C0510012，2011J01188)；福建医科大学重大科研项目(09ZD012)

doi：10.3969/j.issn.1006-2084.2015.20.004

中图分类号：R963

文献标识码：A

文章编号：1006-2084(2015)20-3657-03