微波辅助酶法提取燕窝唾液酸及其益智功能性的研究

范群艳++陈昕露++连建梅++陈玲++张怡

摘 要 为优化燕窝唾液酸微波结合木瓜蛋白酶提取工艺，并研究燕窝对幼鼠学习记忆能力的影响。在单因素试验的基础上，选取微波处理时间，酶解温度和pH三个因素进行响应面实验设计，优化燕窝唾液酸的提取工艺；采用水迷宫试验，测试燕窝对正常幼鼠学习记忆能力的改善作用。确定了燕窝唾液酸微波结合木瓜蛋白酶提取的最优工艺，工艺参数为微波时间100 s，酶解温度60℃，pH 7，在此条件下唾液酸提取率为12.58%；水迷宫试验表明，燕窝唾液酸提取液灌胃组幼鼠寻找平台平均潜伏期均缩短，穿越平台次数都增加。响应面法优化微波结合木瓜蛋白酶提取得到燕窝唾液酸的工艺，燕窝对幼鼠的学习记忆能力有一定的改善作用。

关键词 燕窝 ；唾液酸 ；幼鼠 ；学习记忆能力

分类号 TS201.4 ；R284.I

Microwave-assisted Enzymatic Hydrolysis of Birds Nest Sialic Acid

and Its Effect on Improving Intelligence of Young Rats

FAN Qunyan1） CHEN Xinlu2） LIAN Jianmei1） CHEN Ling1） ZHANG Yi2）

（1 Xiamen Seelong Food CO. LTD， Xiamen， Fujian 361101；

2 College of Food Science， Fujian Agriculture and Forestry University，

Fuzhou， Fujian 350002， China）

Abstract The Optimized microwave-papain extraction of sialic in edible bird nest， and the effects of sialic on learning and memory in young rats were studied. On the basis of single factor experiment， the microwave processing time， enzyme temperature and pH were considered using response surface methodology； The stewed edible bird's nest and sialic acid standard group for the learning and memorizing ability of SD rats were observed by Morris water maze. It shown that microwave treatment could improve the hydrolysis rate， when the condition was microwave power 400W， microwave time 100 s， enzymolysis temperature 60℃， pH 7， the experimental sialic acid yield of （12.58±0.08）% was achieved. Through the water maze experiment， the test group rats could find the platform faster and more often， which indicated that certain dose of bird nest can enhance the abilities of learning and memory of young rats.

Keywords birds nest ； sialic acid ； young rats ； learning and memorizing abilities

燕窝是雨燕科（Apedidae）雨燕目中部分金丝燕分泌的唾液与其绒羽混合粘结所筑成的巢穴[1]。产于我国南部沿海一带及越南、马来西亚、印度尼西亚、泰国、缅甸等地。燕窝富含丰富的蛋白质、糖类和矿物质，其重要特征成分为唾液酸糖蛋白。唾液酸是一种神经氨酸的衍生物，广泛存在于多种生物组织中。近年来研究发现，唾液酸及其衍生物在各种生命活动调节中起重要作用[2-5]。Morgan等[6]研究表明，随着摄入唾液酸含量的增加，动物幼崽完成迷宫学习任务的能力提高，说明摄入外源唾液酸对动物幼崽发育起到重要作用。

木瓜蛋白酶提取燕窝中的唾液酸，能提高唾液酸的溶出量，提高提取率；但酶解反应所需的时间较长，速度较慢[7]。微波提取技术作为一种近年来较常用的技术，具有提取时间短、选择性高、耗能低、提取条件温和等优点[8-10]。因此本研究采用微波辅助酶法提取燕窝中唾液酸，分析各因素对燕窝唾液酸提取效果的影响，并通过响应面法优化其工艺参数，为燕窝唾液酸的综合利用奠定基础。同时以唾液酸纯品和益于脑发育物质——脑复康为对照，研究燕窝唾液酸提取液对幼鼠学习记忆能力的影响，为功能性燕窝新产品的开发提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 材料与试剂

燕窝，原产地马来西亚，厦门市丝浓食品有限公司提供；脑复康（吡拉西坦）片，购于天津金世制药有限公司；唾液酸标准品，Sigma公司出品；其他试剂均为分析纯；木瓜蛋白酶（酶活力为2.5×106 μ/g），北京化学试剂公司；实验动物，昆明种幼鼠（清洁级），雄雌各半，体重10～12 g，由福建医科大学实验动物中心提供。

1.1.2 仪器endprint

PL602-L电子天平（梅特勒-托利多仪器上海有限公司）、DHG-9053A型电热恒温鼓风干燥箱（上海精宏实验有限公司设备有限公司）、L530离心机（长沙湘仪离心机仪器有限公司）、C21-SH2126美的电磁炉（广东美的生活电器制造有限公司）、MRO-DF6-H微波炉（日本日立电器有限公司）、DS-200型电动高速组织捣碎机（江苏江阴市科研器械厂）、Morris水迷宫操作系统（深圳市瑞沃德生命科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 唾液酸提取工艺流程

燕窝粉末→酶处理→微波处理→灭酶→离心取上清液→燕窝唾液酸。

操作要点（1）燕窝粉末的制备：称取一定量的燕窝，研磨过40目筛备用；（2）酶处理：称取一定量燕窝粉末，按燕窝∶水（m/m）为1∶20的比例加入蒸馏水，加入4%木瓜蛋白酶（以燕窝粉末计），在一定的酶解温度、时间和pH的条件下进行酶解。（3）微波处理：将酶解好的混合液在一定功率、时间下进行微波提取。（4）灭酶：将微波处理后的混合液在沸水浴中灭酶10 min。（5）离心：在3 000 r/min条件下离心10 min，取上清液即为燕窝唾液酸提取液。

1.2.2 唾液酸提取率

（1）标准曲线的制备[11]

称取一定量的唾液酸标准品，分别配制成0、5、10、20、50、100、200 μg/mL标准唾液酸溶液，吸取1 mL，加入冰醋酸和酸性茚三酮试剂各1 mL，在沸水浴中煮沸保温10 min，冷却至室温后，于470 nm波长处测定吸光值。以唾液酸浓度（C）为横坐标，吸光度（A）为纵坐标，得标准曲线，A=0.005 1 C+0.020 4（R2=0.998）。

（2）提取率计算

取燕窝唾液酸提取液同1.2.1操作，通过标准曲线得到样品中的唾液酸浓度，并计算提取率，计算公式为：

x=×100

式中，x：样品中唾液酸提取率，%；

c：从标准曲线上查到的唾液酸浓度，μg/mL；

50：提取后定容体积，mL；

m：样品的质量，g；

0.134 7：1 g标准燕窝中唾液酸的含量，g。

1.2.3 唾液酸提取液对幼鼠学习记忆能力的影响

（1）动物分组与给药

SD幼鼠随机分组，每组10只（雌雄各半）。设空白对照组（0.9%生理盐水），唾液酸标准品组（0.50 mg/mL），燕窝唾液酸组（高70 mg/mL、中30 mg/mL、低10 mg/mL），脑复康组（225 mg/mL），每日灌胃量为0.2 mL，连续灌胃21 d，自由饮水和进食。

（2）水迷宫实验[12]

末次给药后，进行水迷宫行为测定。实验的内容包括隐藏平台获得实验、空间搜索实验训练。通过记录与分析幼鼠平均找到逃避潜伏期、运动轨迹等，判断幼鼠的学习和记忆能力是否提高。

平台获得实验：实验训练5 d，每天4次，每次间隔5 min。以寻找水下平台潜伏期（s）作为判断幼鼠学习记忆能力的指标，如果幼鼠在1 min内找到平台，让其在平台上停留10 s；如果未找到安全平台，则将幼鼠引至安全平台并在平台停留10 s，逃避潜伏期记为60 s。

空间搜索实验：5 d训练结束后，在第6 天撤去安全平台，将幼鼠释放入水中，游泳60 s，测量60 s内幼鼠穿越原平台放置处的次数。

1.2.4 数据统计分析

利用Design-Expert 8.0.6统计分析软件进行数据处理。

2 结果与分析

2.1 单因素实验

2.1.1 酶解温度对唾液酸提取率的影响

在一定的酶解温度条件下，pH为8，酶解2.5 h，燕窝唾液酸提取率均随着酶解温度的增大而先上升后下降，最适酶解温度为55℃（图1）。温度对酶催化反应的影响由于其复杂性，还未完全清楚，一般来说，温度是影响酶活性的主要原因，而温度促使酶蛋白变性是可随时间累加的[1]。

2.1.2 酶解时间对唾液酸提取率的影响

在酶解温度为45℃，pH为8的条件下进行酶解。结果由图2可知，燕窝经酶解2 h后，提取率达8.7%，之后唾液酸提取率趋于稳定。

2.1.3 pH对唾液酸提取率的影响

在酶解温度为45℃，一定pH条件下酶解2.5 h，酶解最佳pH值均为7（图3）。燕窝唾液酸提取率随pH值的升高而升高，当pH值为7时最高，随后下降。pH值影响酶催化速度，pH不同，酶及作用底物所带电荷不同，酶的立体构象以及酶与底物的亲和力不同，催化速度也就不同[14-15]。

2.1.4 微波功率和微波时间对唾液酸提取率的影响

通过均匀试验研究微波功率及微波时间对燕窝唾液酸提取率的影响，由表1可知，微波功率400 W，微波时间60 s时，唾液酸提取率最高。这是因为微波功率越高、作用时间越长，则热效应越明显，而温度高蛋白酶易失活。微波可以改善酶催化的反应体系，一方面可能改变了酶的活性中心立体结构，另一方面增加了底物与酶基团的接触，从而提高酶催化反应速度[16]。

2.2 响应面试验优化

选用Box-Benhnken实验设计原理，选取微波处理时间（A）、酶解温度（B）及pH值（C）3个影响因素，以唾液酸提取率为响应值Y，采用Design-Expert 8.0.6软件对提取工艺进行响应面分析（表2），得到回归方程：

Y=10.56+0.039×A+0.089×B-0.045×C-0.45×A×B-0.073×A×C-0.25×B×C-0.20×A2-0.20×B2-0.19×C2。endprint

由方差分析结果（表3）可知，微波处理时间、酶解温度及pH在燕窝唾液酸的提取过程中有较显著影响，失拟项不显著，相关系数的平方R2=0.986 8。综上所述，该模型可为分析和预测燕窝唾液酸的提取提供一个合适的模型。

以微波处理时间（A）、酶解温度（B）及pH值（C）这3个影响提取率的因素两两组合为自变量，以燕窝唾液酸提取率为相应指标绘制响应面及等高线图，用来评价各因素两两组合对提取率的交互影响作用，如图4～6。

由等高线图可以看出，酶解温度、微波时间和pH两两交互作用极显著。由响应面图可以看出，当酶解温度一定时，唾液酸提取率随微波时间的延长表现出先上升后下降的趋势。当pH一定时，唾液酸提取率随微波时间的延长呈现出先上升后下降的趋势，当pH一定时，唾液酸的提取率随温度的增高而增大，随着pH的逐渐增加，唾液酸提取率呈现先上升后缓慢下降的趋势。

响应面分析法得到燕窝唾液酸提取率最佳工艺条件为微波时间100.19 s，酶解温度59.98℃，pH 6.95，预测提取率为12.61%。为了进一步证实该模型的模拟结果，在酶解温度为60℃、pH为7.0的条件下微波处理100 s，平行提取3次，测得平均值为12.58%，预测值接近真实值，有很好的拟合性，进一步验证了该模型的可靠性。

2.3 燕窝唾液酸提取液对改善幼鼠学习记忆能力的作用

Moms水迷宫试验现是检测动物记忆水平的重要工具，是Richard Morris在1981发明的。国内外学者将益智类药食品灌胃大小鼠等，以水迷宫试验评价是否有助于动物学习和记忆能力[17-19]。由表4可知，在定位航行实验中，各个组别的幼鼠随着寻找平台试验次数的增加，平均潜伏期都缩短，且燕窝唾液酸各剂量组幼鼠寻找平台的平均潜伏期均比对照组短。其中，燕窝唾液酸中剂量组的平均潜伏期分别比燕窝低、高组短，略低于唾液酸标准品组，与脑复康的作用相当。观察第6天的空间搜索实验结果表明，相比于对照组，各试验组穿越平台次数均有所增加，燕窝唾液酸中剂量组在燕窝唾液酸组中穿越平台次数中最高，次数略低于唾液酸标准品组和脑复康组。脑复康作为药品在医学中已有较深入的研究，研究证明其有抗老年痴呆、改善学习记忆功能的作用[20]。由此说明燕窝唾液酸提取液具有一定的改善小鼠学习记忆的功效。

3 结论与讨论

采用响应面分析法优化了燕窝唾液酸的提取工艺，其最佳条件为：微波时间100 s，酶解温度60℃，pH 7.0，该工艺条件下燕窝唾液酸的提取率为12.58%。

学习与记忆是动物和人类生存中重要的脑功能，人类区别动物的智力活动也是基于此。学习与记忆是一个复杂的研究领域，涉及多门学科，本试验采用幼鼠进行动物试验，初步证明了燕窝唾液酸提取液对于动物具有增长学习记忆能力的作用，但其影响机理需今后进一步研究。

参考文献

[1] 胡雅妮，康廷国. 燕窝的研究进展[J]. 中国中药杂志，2003，28（11）：10-12.

[2] 魏冬旭，江连洲，王 辰，等. 唾液酸生物活性及其应用的研究进展[J]. 中国食物与营养，2011，17（7）：64-68.

[3] Schauer R. Sialic acids： fascinating sugars in higher animals and man[J]. Zoology （Jena）， 2004， 107（1）： 49-64.

[4] 张 杰，徐文方. 唾液酸及其衍生物的应用前景[J]. 中国新药杂志，2004，13（12）：1 253-1 257.

[5] Traving C， Schauer R. Structure， function and metabolism of sialic acids[J]. Cell Mol Life Sci， 1998， 54（12）： 1 330-1 349.

[6] Morgan B L， Winick M. A possible relationship between brain N-acetylneuraminic acid content and behavior[J]. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine， 1979， 161（4）： 534-537.

[7] 杨 萍，郑先哲. 酶法提取黑甜糯玉米多糖技术初探[J]. 中国食品添加剂，2012，5：149-153.

[8] 张晓娟，胡选萍，冯自立，等. 微波辅助酶法提取茯苓中茯苓多糖的工艺研究[J]. 安徽农业科学，2009，37（28）：3 793-3 794.

[9] Bhole D， Allikian M J， Tower J. Doxycycline-regulated over-expression of hsp22 has negative effects on stress resistance and life span in adult Drosophila melanogaster[J]. Mech Ageing Dev， 2004， 125（9）： 651-653.

[10] 冯红霞，江连洲，李 杨. 超声波辅助酶法提取油茶籽油的影响因素研究[J]. 食品工业科技，2013，34（6）：272-279.

[11] 李 敏，黄华军，奚星林，等. 燕窝中唾液酸含量的分光光度测定方法[J]. 中国卫生检验杂志，2011，21（3）：598-600.endprint