综述表面增强拉曼散射光谱体内药物分析技术

石玉也+鹿爱娟+黄小燕+陈传品+刘文芳

摘要：表面增强拉曼光谱（SERS）作为一种新兴的药物分析手段，具有样本处理简单、非侵入性检测、灵敏度高、提供丰富指纹图谱信息等优点，在实现高灵敏度无损检测的同时可获得目标检测物的分子结构信息。本文综合论述了体内药物分析的常用方法以及SERS在该方面的发展现状，并详细介绍了SERS基底的分类和制备方法以及SERS在药物分析尤其是体内药物分析方面的应用。针对体内药物分析，主要介绍不分离样本情况下，SERS用于唾液、尿液、血液等生物样本中目标检测物的直接分析技术。

关键词：体内药物分析；生物样本；表面增强拉曼光谱

中图分类号：G642 文献标志码：A 文章编号：1674-9324（2015）15-0053-03

一、前言

表面增强拉曼光谱（SERS）是一种利用表面电磁场增强提高拉曼信号的分析技术。与红外（IR），紫外（UV），核磁共振（NMR），荧光，X-衍射等光学分析手段相比，具有很多突出优势。表面增强拉曼检测限非常低，可用于痕量分析，甚至可以实现目标检测物的单分子检测；分析过程只需要数毫秒到数十秒不等，可实现对被分析物快速检测和实时信息反馈；能够提供丰富的指纹图谱信息而具有较高的分析准确性；水分子的拉曼响应较弱，因此适用于含水样本的分析，尤其是生物样本，无需复杂的前处理即可检测；与其他分析方法如IR，核磁共振等相比，对样本纯度要求低，可大大减少样本前处理工作并节约分析成本；拉曼检测所需样本量极少，且为非入侵破坏性检测，可为目标检测物的后续分析提供方便。因其可以从复杂基质中提取目标分子结构信息，故表面增强拉曼光谱尤其适用于生命科学方面的分析应用。体内药物分析是指利用仪器对人或动物体内的血液、尿液、体液、排泄物、组织、器官等样本中药物及其代谢物的分布进行分析，了解药物进入体内后代谢的途径以及代谢方式等信息，从而指导药品的生产和临床应用。体内药物分析最大的挑战是生物样品成分复杂、药物及其代谢物浓度低。一般而言，样本中除了目标检测物外，还含有大量的蛋白质、多种内源性物质等，而药物本身的代谢产物、其他共存的药物等也会对检测形成一定的影响。因此其对分析仪器的分离效率和检测限有较高要求。表面增强拉曼光谱由于其超高的灵敏度和指纹图谱分析等优势，在体内药物分析方面展现了良好的前景。

二、体内药物分析常用方法

目前常用的几类生物样品分析方法有：①色谱法，可用于大多数药物的检测。②免疫学方法，多用于蛋白质多肽类物质检测。③微生物学方法，主要用于抗菌药物的测定。

三、表面增强拉曼散射简介

与红外光谱相似，拉曼光谱是一种分子振动、转动光谱。但前者是通过检测分子偶极矩的变化，而后者则通过分子极化率的改变获得相关信息。普通拉曼光谱的信号响应非常弱，其强度大约只有激发光的10-10倍。同时，普通拉曼光谱的荧光干扰非常强，即便是目标物或者基质中极弱的荧光响应，也能覆盖拉曼散射。20世纪70年代，Fleischmann等首次报道了在粗糙的银电极表面吸附的单层吡啶的高质量拉曼光谱。三年后，Van Duyne等证明吸附在粗糙银表面的每个吡啶分子的拉曼信号强度在比其在溶液中增强了106倍。该现象被定义为表面增强效应。SERS是指当目标检测分子被吸附到某些粗糙的金属表面（如金、银、铜等）上时，它们的拉曼散射强度会增加104～106倍；谐振时，可以高达1014～1015倍，其中又以银的增强效果最佳。目前认为SERS增强主要基于电磁场增强和化学增强两种机制，纳米粒子的形貌尺寸以及与相邻纳米粒的距离均会影响粒子周围的电磁场，进而影响增强效果，并且被测分子只有位于金属纳米粒产生的电磁场中时才会产生增强的效果，电磁场越强，增强效果越好。目前SERS技术已经广泛应用于生物学、材料学、电化学、医药学等各个方面。

四、表面增强拉曼散射用于药物分析

SERS应用于药物分析是近几年才发展起来的。拉曼光谱可以从以下几个方面应用于药物分析：①药物的基础结构鉴定：拉曼光谱已经被用于多种药物的结构分析，包括苯乙胺类镇静催眠药、手性的β受体阻断剂，镇静催眠药等。②对活性成分的定量分析：目前已有通过偏最小二乘法和线性回归分析阿司匹林、对乙酰氨基酚的拉曼数据，进行定量检测的相关报道。在选定的拉曼光谱频率区间内，通过改变参数可以对药物中的活性成分进行准确检测。通过对拉曼光谱的分析，已经实现了抗生素中含有的对乙酰氨基酚单斜和正交晶系含量的准确检测。③药物的晶型的分析：拉曼光谱也可以用于药物的多晶型分析。盐酸雷尼替丁片中包含有两种晶型的药物——Ⅰ型和Ⅱ型，这两种晶型可以采用拉曼光谱进行区别并确定含量。该研究认为，拉曼光谱是一种可以用于定量分析晶型含量的有效方法，商业药品中的多晶型杂质应低于2%。目前，SERS用于药物分析的相关研究主要集中在药物标准品等纯度较高体系的分析。已有相关研究包括检测苯丙胺、地西泮等精神类药物，吗啡、可待因等麻醉药物，地虫硫磷等农药，另外还有5-氟尿嘧啶，利福霉素，阿司匹林等。这些研究多以银纳米溶胶为增强基质，检测标准样本中的药物，其最低检测浓度可以达到10-6 mol/L。采用SERS分析生物的样本中的目标检测物也有一定测尝试。

五、表面增强拉曼散射用于体内药物分析

直接检测是表面增强拉曼散射最普遍的检测方式，目标分子吸附在金属纳米粒上，即可得到目标分子的指纹图谱。大分子和小分子物质的痕量检测都有大量的文献报道。用于生物样本中的直接检验主要针对于单一目标检测，根据生物样本的种类，可分为唾液样本分析，尿液样本分析和血液样本分析。唾液分析相对血浆等常用生物样本有其独特的优势。首先，样本的获得不会对受试者产生创伤，减少了试验的危险性和不良事件的产生。其次唾液成分简单，99.5%以上的成分都是水，因此对样本的处理要求也相对简单而可以节约实验成本和时间。第三，在微克级别时，唾液中的药物含量与血液中的浓度几乎是一致的。采用硅醇还原银或金离子获得SERS活性的毛细管，唾液中5-氟尿嘧啶，毒品（苯丙胺、地西泮、美沙酮、可卡因）等的检测均已实现，但技术尚不成熟，检测限也较高。前者先加水对唾液进行稀释，在去除硫氰酸根离子等的干扰后，其5-氟尿嘧啶的检测限可以达到50μg/mL。Frank Inscore等对唾液样本进行固相萃取后，将其注入含金或银溶胶的毛细管，并采用便携式拉曼光谱仪检测，分别检测出了样本中含有的可卡因、苯丙胺、海洛因等药物。其检测限虽只有0.5μg/mL，但采用便携式拉曼光谱仪进行检测，为样本的现场鉴定和实时检测提供了可能。endprint

尿液是一种常见的样本，在美国，每年大约有3亿的尿液相关分析。Charles J. Choi在常用的IV或尿液收集软管中嵌入了紧密排列的纳米汞和SERS传感器，实现了人工尿液中异丙嗪和尿素的在线定量监测。其浓度—信号强度曲线的相关系数为0.999，其检测限大约为3mg/mL。Gerd Trachta等采用HPLC-SERS联用的方法检测了尿液和血液中的双氢可待因、多赛平、西酞普兰，曲米帕明，卡马西平，美沙酮等药物含量。该方法用乙酸乙酯对样本进行萃取富集后，再采用HPLC进行分离，根据保留时间取分离后的样本至SERS增强基底上，进而实现SERS分析。采用该方法，他们检测了两个过量使用精神药物而致死患者的尿液和血液，获得了相关药物的SERS图谱。血液是人体组织的重要组成部分，当人体组织处于不同状态或人生理状况发生变化时，体内代谢物质在血液中将有所反映，通过分析人血液的拉曼光谱以实现人体疾病的检测是国内外学术界关注的研究课题，按照全血取样后的处理方法，又包括血浆和血清两种。表面增强拉曼散射（SERS）技术具有高检测灵敏度、可提供指纹图谱、样品前处理简便，同时血液中富含的各种生化物质容易与金属纳米粒子相结合，因此，将SERS技术应用于人体血液检测具有特别的优势。同时血液样本具有易于获得，容量较大，相关报道较多而易于对比借鉴等优点。其中，血液中抗癌药物的SERS检测具有重大意义。抗癌药物副作用与用药剂量有显著关系，故通过个体化监测血药浓度来调整给药剂量可显著降低抗癌药物的副作用，提高病人对药物的耐受性。Yuen C等用SERS检测血浆样本中的紫杉醇。其以微波处理金薄膜-聚乙烯颗粒，获得重现性较高，增强效果非常好的增强基底。其标准血浆样本基本不需要进一步处理即可进行检测，且检测限可以达到10-8mol/L。

六、总结

SERS由于其超高的灵敏度，在体内药物分析中的发展不容小觑，虽然目前技术尚不成熟，但其基础研究与应用越来越受到大家的重视。目前，SERS应用于体内药物分析面临的主要问题是：生物样本的背景干扰太强，影响检测；检测限太高，难以达到体内药物分析的要求；常规方法所得基质重现性较差，难以应用过于体内药物分析。这些问题都需要通过改进增强基底加以改进，尤其是好的增强基底不仅需要有足够的增强效果，更需要能满足体内药物分析的重现性。目前已经有针尖增强拉曼光谱、各种有序的纳米粒阵列、甚至复合增强基底，可以实现单分子检测且能保证一定的重现性。同时编码纳米粒以其能植入芯片、活细胞、组织和一些列微小器官进行间接检测，展现出广大的应用前景。但其应用均停留在实验室制备阶段，距离推广使用还有一定的距离。而将SERS分析发展成为一种标准的体内药物分析手段则还需要更多的深入研究。

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