人类博卡病毒的研究进展

全　瑶，张素红(综述)，黄　婷(审校)

(南京市高淳人民医院儿科，南京 211300)



人类博卡病毒的研究进展

全瑶※，张素红(综述)，黄婷(审校)

(南京市高淳人民医院儿科，南京 211300)

摘要：人类博卡病毒(HBoV)属于细小病毒科细小病毒亚科的博卡病毒属，是迄今发现的继细小病毒B19之后能感染人的第二类细小病毒。现已发现的HBoV可分为HBoV-1、HBoV-2、HBoV-3和HBoV-4四型。研究显示，HBoV在不同类型的标本中均有检出，检出率差异较大，且较多合并其他病原体的检出。现有的研究结果表明，HBoV不仅可能是呼吸道疾病的致病原，也有可能是胃肠道疾病的致病原。

关键词:人类博卡病毒；生物学性状；致病性；检测方法

2005年8月，瑞典科学家Allander等[1]对儿童急性上呼吸道感染样本进行大规模筛查时，发现一种与已知的细小病毒类似的新病毒，因其与牛和犬博卡病毒同源性很高，故将其命名为人类博卡病毒(human Bocavirus，HBoV)。2009年1月Kapoor等[2]从非脊髓灰质炎感染急性弛缓性麻痹患儿粪便中发现HBoV2，其后HBoV3[3]和HBoV4[4]也相继被发现。在分类学上，认为HBoV属于细小病毒科细小病毒亚科的博卡病毒属，HBoV是迄今发现的继细小病毒B19之后能感染人的第二类细小病毒。根据HBoV的全基因组测序和序列分析结果，HBoV可分为HBoV1、HBoV2、HBoV3和HBoV4四型。目前尚未确定4种HBoV代表不同的病毒株，还是一种病毒株的不同基因型。现有的研究结果表明，HBoV不但是呼吸道疾病的致病原，也有可能是引起小儿急性胃肠炎的致病原[5]。现对HBoV的生物学性状、流行特征、疾病相关性、检测方法等方面予以综述。

1HBoV的分子生物学特征

HBoV基因组为单链线性DNA，全长约为5.6 kb，形态与其他细小病毒十分相似，是一类无包膜的小颗粒病毒，电镜下颗粒直径为20～25 nm[6]。4型HBoV基因组结构基本一致，从5′～3′有3个开放读码区，其中2个开放读码区分别编码非结构蛋白NS1、NP1，另1个开放读码区编码两种病毒衣壳蛋白VP1和VP2。VP1与VP2具有典型的基因重叠区，此外，VP1还具有非重叠区即VP1独特区(VP1u)[7]。5′端left-end hairpin(LEH)及3′端right-end hairpin(REH)具有回纹序列，形成茎环、发卡样复杂二级结构[8-11]。

细小病毒NS1基因最早被转录、翻译，经证实其在病毒复制过程中起到超激活的作用[12-15]；非结构蛋白NP1与病毒复制有关，并且在逃避宿主固有免疫中发挥重要作用[15]。HBoV VP1有磷脂酶A2样活性，对病毒感染人体起着重要作用，能帮助病毒从细胞质进入细胞核内进行基因的复制与转录[16-17]。VP1、VP2基因比较保守，VP1、VP2蛋白具有良好的抗原性，因此常用于HBoV的血清学检测[18]。有研究通过原核表达HBoV1 VP1u和VP2蛋白，利用免疫斑点技术对哮喘患儿血清进行HBoV1 IgG及IgM检测，结果显示相较于VP1u，VP2有更强的免疫活性，证明VP2是HBoV血清学检测的理想抗原[19]。所以目前较多的研究针对VP2结构蛋白制作单克隆抗体，建立快速病毒检测方法，从而能方便用于临床工作中。

2HBoV的流行特征

2.1流行概况自Allander等[1]第一次发现HBoV后，世界各地均有HBoV的检出，表明HBoV感染呈全球性分布。由于标本的采集对象、方法、季节、保存方法、实验技术、引物的设计及方法的敏感性及特异性不同，HBoV DNA检出率差别较大。虽然HBoV DNA在呼吸道标本、粪便标本、血清标本、尿液、脑脊液等中均有检出，但目前HBoV DNA的检测主要针对呼吸道及胃肠道标本。研究显示，在有呼吸道症状患者的呼吸道标本中HBoV DNA检出率为0.8%～19%[5-6]，在胃肠道疾病患者粪便标本中HBoV DNA检出率为0.8%～9.1%[2-5]。

2.2年龄分布HBoV可以感染不同年龄组人群，年龄分布从新生儿至60岁以上，其中易患人群为低年龄阶段儿童,尤其是6个月至2岁的婴幼儿。考虑6个月以下的婴儿的感染率较低的原因，可能与母传保护性抗体尚未消失有关；之后随着机体自身免疫的逐渐形成，HBoV的感染率呈下降趋势。

2.3季节分布HBoV感染高峰的出现没有时间差异性，许多研究均显示HBoV感染没有明显的季节性分布[20-22]。美国Kesebir等[20]报道，HBoV检出高峰出现时间为1～3月和 10～12月。法国报道的流行高峰主要集中在3～4月份[21]。日本东京地区，HBoV阳性标本大部分集中在1～5月，高峰出现在4～5月[22]。我国已有的研究结果也显示，HBoV感染没有明显的季节分布[23]。

2.4血清流行病学Kahnd等[24]采用酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immuno sorbent assay，ELISA)方法，报道人群HBoV1 IgG阳性率为72.7%，2个月以下的婴儿和5岁以上的儿童HBoV1 IgG阳性率均>85%。成人血清HBoV1 IgG阳性率高的原因考虑可能是由于机体被HBoV1感染过后产生了保护免疫。年龄<6个月的婴儿也有较高的阳性率，有学者认为是母体抗体通过胎盘传递至婴幼儿的缘故[25]。相较于HBoV1，HBoV2～4感染率及刺激B细胞克隆选择性活化度较低。Kantola等[26]通过构建重组病毒样颗粒的酶免疫分析法检测HBoV2～4抗体，成人血清流行率分别为34%、15%和2%。HBoV1～4型之间具有较高的氨基酸同源性，研究发现HBoV1～4主要抗原VP2蛋白之间存在血清学交叉反应，这也可能是导致HBoV1血清阳性率高的原因。在去除HBoV2～4抗体的影响的情况下，成人HBoV1抗体阳性率从96%降至59%。

3HBoV的疾病相关性

HBoV DNA在不同类型的标本中均有检出，其中HBoV1和HBoV2 DNA的检出率最高。呼吸道标本HBoV1 DNA检出率较高，HBoV2 DNA主要在消化道标本中检出。在此主要总结HBoV感染与呼吸道疾病、胃肠道疾病以及脑炎的疾病相关性。

3.1HBoV与呼吸道疾病目前HBoV研究与呼吸道疾病的研究基本采用聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)或实时荧光定量PCR检测。主要感染对象为2岁以下婴幼儿，临床表现常以发热、咳嗽、流涕、喘息、呼吸困难等症状，肺炎、支气管炎、鼻炎、咽喉炎、哮喘的发生率也相当高。急性呼吸道感染患者呼吸道标本中主要检出的基因型为HBoV1，文献报道HBoV1与重症肺疾病及儿童喘息密切相关[21]。

HBoV DNA阳性的呼吸道标本常检出伴有其他病原体的混合感染，常见的共感染病原体为鼻病毒、流感病毒及呼吸道合胞病毒，而且由于尚未建立成熟的体外培养体系及敏感的动物模型，所以有学者对HBoV的呼吸道致病性提出了质疑[20-21]。2012年Huang等[27]通过扩增HBoV1末端回纹序列，构建了HBoV的全基因组，并转染HEK293细胞，检测出有子病毒的产生，同时感染原代支气管上皮细胞后发现产生了细胞病变效应。HBoV1的感染性克隆的成功构建，证明HBOV1可以引起呼吸系统病变。综合目前的一系列的研究结果，目前考虑HBoV1与呼吸道感染有相关性。同时有研究报道无呼吸道症状患者几乎无HBoV DNA检出，同时实时荧光定量PCR检测显示HBoV在感染人体后，可以在呼吸道以低载量状态长期存在，一系列的研究证实呼吸道症状仅与病毒的高载量在统计学上呈相关性[28-29]，所以关于HBoV的呼吸道致病机制尚待进一步明确。

3.2HBoV与胃肠道疾病HBoV1 DNA在呼吸道标本检出较多，而HBoV2～4 DNA主要在腹泻患儿的粪便标本中检出。相对于HBoV3及HBoV4，HBoV2在腹泻患儿的粪便标本中检出率和遗传差异相对较高。患者的主要表现为恶心、呕吐、腹泻等急性胃肠病的典型症状，部分患儿可伴有呼吸道症状。虽然目前的研究结果提示HBoV与儿童腹泻病的关系密切[30-31]。然而尚有大量的病例对照研究结果并不完全支持这一结论，因为在健康儿童粪便标本中也有HBoV DNA的检出，两者间HBoV DNA的检出率比较差异无统计学意义，而且胃肠炎患者的胃肠道标本中常检出轮状病毒、杯状病毒、星状病毒等共感染，所以HBoV到底是胃肠道疾病的致病原还是肠道的“过路者”尚不能得出结论[32]。

3.3HBoV与脑炎的相关性2012年Mitui等[33]在4例脑炎患儿的脑脊液中检测出HBoV DNA，基因分型显示2例为HBoV1、2例为HBoV2，未检测出其他病毒混合感染，并且其中1例HBoV2感染患儿出现了病毒血症。2013年Yu等[34]同样在67例脑炎患儿的脑脊液中用PCR方法检测出10例HBoV DNA阳性，其中9例为HBoV1、1例为HBoV2。所以HBoV是否可以引起病毒性脑炎值得进一步研究。如果能引起脑炎，HBoV又是如何透过血脑屏障进入脑脊液或者是怎样损害血脑屏障的问题值得下一步的探索。

4HBoV的检测方法

关于HBoV感染诊断目前仍无统一标准。因为针对HBoV的体外培养系统和动物模型尚不成熟，所以主要采用PCR扩增临床样本的HBoV基因组进行检测。ELISA、免疫印迹、免疫荧光检测的建立可进一步用于血清中HBoV IgG和IgM抗体的检测[19，35-36]。电镜技术也可运用于病毒的检测，然而因电镜标本制作比较繁琐，且价格昂贵，所以其在HBoV感染的检测应用中受到局限，目前主要用于病毒的形态结构观察。

4.1分子诊断HBoV的分子诊断主要采用PCR扩增方法。针对HBoV的不同基因，如NS1、NP1或VP1、VP2，设计特异性的引物，检测患者呼吸道、血清、粪便及尿液等临床样本中的HBoV基因组。目前PCR扩增方法主要为常规巢式PCR和实时荧光定量PCR两种[37]。实时荧光定量PCR有检测敏感性高、特异性好，通过荧光信号检测可以直接对产物进行定量检测，且操作简单安全，不易产生污染等优点。虽然巢式PCR费时费力易出现假阳性，但巢式PCR在检测成本上有明显优势，而且研究显示巢式的敏感性与实时荧光定量PCR比较差异无统计学意义。

4.2血清学诊断虽然PCR是一项针对HBoV核酸的快速、敏感的检测技术，但实时荧光定量PCR检测显示标本中HBoV病毒载量较低，且有研究发现HBoV在感染人体后，可以在呼吸道以低载量状态长期潜伏[38]，表明PCR检测并不能明确HBoV的急性感染。血清学检测方法可以弥补PCR检测技术的不足，成为另一种重要的HBoV检测的方法。Kantola等[26]提出了HBoV急性期感染的血清学诊断标准：含以下标志中至少两项：HBoV IgM抗体产生；HBoV IgG抗体效价4倍增高或转换；HBoV IgG低活性；病毒血症。血清学检测针对HBoV的特异性抗体的产生、变化过程及规律，是一项可靠的急性期血清学检测方法[39]，从而为疾病的防治提供既往感染规律、人群易感性等血清流行病学依据。

5小结

HBoV是新发现的一种单链DNA病毒，目前国内外在HBoV的分子生物学及流行病学方面的研究已取得一定的成就。HBoV1的感染性克隆的成功构建表明HBoV1可以引起呼吸系统病变，然而HBoV的胃肠道致病性尚未明确。为了解HBoV的致病性及致病机制，除了感染性克隆的构建，筛选易操作的敏感细胞系，建立动物模型等基础性工作仍需要进一步开展，从而有助于呼吸道及胃肠道疾病的预防及治疗。

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Progress in and Research of Human BocavirusQUANYao,ZHANGSu-hong,HUANGTing.(DepartmentofPediatrics,NanjingGaochunPeople′sHospital,Nanjing211300,China)

Abstract:Human Bocavirus(HBoV) is another parvovirus known to infect and cause illness in human besides Parvovirus B19. HBoV is classified as genus bocavirus in the family of Parvoviridae.So far,four different subtypes of HBoV(HBoV1-4) have been found.HBoV has been detected in different kinds of samples.The detection rate of HBoV infection varies widely,and is often co-detected with other pathogens.The existing results show that HBoV may not only be the pathogen of respiratory tract disease,but also the pathogen of gastrointestinal disease.

Key words:Human bocavirus; Biological characters; Pathogenicity； Detection method

收稿日期：2015-01-19修回日期：2015-04-23编辑：相丹峰

doi：10.3969/j.issn.1006-2084.2015.21.009

中图分类号：R725.7

文献标识码：A

文章编号：1006-2084(2015)21-3864-03