白血病融合基因及检测方法研究进展

肖　恒(综述)，李守霞(审校)

(邯郸市中心医院检验科，河北 邯郸 056001)

白血病融合基因及检测方法研究进展

肖恒(综述)，李守霞※(审校)

(邯郸市中心医院检验科，河北 邯郸 056001)

摘要：白血病是一种造血干细胞异常克隆增殖性疾病，临床表现主要为骨髓和外周血中白血病细胞大量增殖且分化障碍，其发病与融合基因的形成相关。目前发现的融合基因主要有BCR-ABL、PML-RARA、AML1-ETO、CBFβ-MYH11、TEL/AML1、E2A/PBX1、MLL重排形成的基因、DEK-CAN等，对白血病的诊断和治疗有重要意义。而检测融合基因的方法主要包括荧光原位杂交、免疫印迹、聚合酶链反应、流式细胞术、基因芯片及全基因组测序等方法。

关键词：白血病；融合基因；检测方法

白血病是一类起源于造血干细胞的恶性克隆性疾病[1]，其克隆的白血病细胞增殖失控，分化障碍，凋亡受阻，并在骨髓和其他造血组织中呈恶性增生，使正常造血受抑制，且可浸润其他组织和器官。近年来，随着白血病融合基因的发现及细胞遗传学与分子生物学技术的发展，白血病融合基因和细胞与分子遗传学技术在白血病诊断中逐渐占据重要地位。现就融合基因的表达在白血病诊断中的重要意义及其主要检测方法进行综述。

1白血病融合基因

从在慢性粒细胞白血病中发现BCR-ABL融合基因以来，越来越多的融合基因不断被发现，它们均由染色体重排形成，并成为白血病特异性的分子标志，对认识染色体重排在白血病形成中的作用研究提供了很大的帮助[2]，可用于白血病的分子生物学分型、预后观察及微小残留病(minimal residual disease，MRD)的诊断，目前常见于临床的白血病融合基因主要有以下几种。

1.1BCR-ABL融合基因最早在慢性粒细胞白血病细胞Ph染色体中发现，它由9q34上的原癌基因ABL与22q11上的BCR基因融合形成，即t(9；22)(q34；q11)。其编码生成的BCR-ABL融合蛋白具有高酪氨酸激酶活性，它可通过激活下游多条信号通路而导致细胞恶性转化，并进一步演变为白血病。根据BCR断裂点位置的不同，其编码的蛋白分为p210、p230和p190融合蛋白。据报道，约95%以上的慢性粒细胞白血病患者和20%的急性淋巴细胞白血病(acute lymphoblastic leukemia，ALL)患者的白血病细胞中可表达BCR-ABL基因，因此BCR-ABL融合基因可用作慢性粒细胞白血病等白血病的分子诊断标志物[3]。

1.2PML-RARA融合基因它通过t(15；17)(q22；q22)染色体易位后形成。RARA基因仅有1个断裂点，位于2号内含子，而PML基因有3个断裂点，根据断裂点位置的不同，分别形成长型(55%)、异构体(5%)和短型(40%)3个亚型。PML-RARA的表达可干扰RARA在核内的分布和对细胞分化的调控，使大量细胞阻滞在早幼细胞阶段，从而导致急性早幼粒细胞白血病(acute promyelocytic leukemia，APL)的产生，可见于95%的APL患者，是APL的特异性分子标志[4-5]。其不同的基因异构体分型的预后有明显不同，短型患者缓解前的病死率及缓解后的复发率均高于长型。此外，APL初诊组和复发组的融合蛋白水平常较缓解组高，即PML/RARA融合基因可用于APL的疗效观察、预后判断及监测复发。

1.3AML1-ETO融合基因也被称为RUNX1-RUNX1T1，由t(8；21)(q22；q22)易位形成[6]。AML1-ETO融合基因主要发生于M2型白血病，t(8；21)(q22；q22)阳性的AML患者中40%～50%为M2型，可作为M2b诊断的重要分子标志，其他AML可见于M1、M4、M5。由其表达生成的AML1-ETO融合蛋白是一种转录抑制因子，可抑制正常AML1蛋白介导的功能，改变造血祖细胞自我更新及成熟过程，同时也产生启动异常造血细胞增殖的信号，引起白血病细胞生长。当其阳性时提示预后良好，完全缓解率高达90%，5年存活率达50%～70%。

1.4CBFβ-MYH11融合基因inv(16)(p13；q22)或t(16；16)(p13；q22)，可形成10余种CBFβ-MYH11融合基因转录本，但最常见的A亚型约占80%，D亚型占5%、E亚型占5%。它可干扰核结合因子CBF发挥作用，从而抑制造血分化和诱使细胞向白血病细胞转化。但有敲入小鼠模型证明，CBFβ-MHY11本身并不足以导致白血病表型，可能还需要其他畸变同时存在时才能发挥作用[7]。据报道，约85.7%的M4EO患者CBFβ-MYH11融合基因表达阳性，且阳性提示预后良好。

1.5TEL/AML1融合基因为t(12；21)(p13；q22)易位[8]，它可使AML1编码的CBRa失去与DNA结合能力或不能正常转录而发挥激活靶基因的作用,即AML1从转录激活因子转变成转录抑制因子，同时它表达生成的TEL/AML1融合蛋白还可与野生型AML1竞争结合DNA结合位点，抑制其正常的转录活性，使AML1调节靶基因表达受抑，影响造血干细胞的自我更新和分化能力，是儿童前B-ALL时最常见的染色体异常之一，当其阳性表达时常提示预后较好。

1.6E2A/PBX1融合基因t(1；19)(q13；p22)易位[9]，约见于5%的ALL患者中，在B细胞系ALL中占20%～30%，ALL患者初治期和复发期的E2A/PBX1融合基因表达均高于缓解期，且阳性表达者的无病生存率降低，即E2A/PBX1融合基因可作为ALL及MRD诊断的分子标志，帮助判断预后和指导治疗。

1.7MLL重排形成的基因MLL基因位于11q23，白血病时尤其是AML时其可发生重排而形成融合基因，且种类和数目众多，约占AML相关融合基因的3/5。如t(11；4)(q23；q21)易位形成的MLL/AF4融合基因，95%见于ALL[10]。此外，还有t(9；11)(p22；q23)形成的MLL/AF9融合基因，可见于86%的M5型AML[11]，及t(11；19)(q22；p13)形成的MLL-ENL 融合基因[12]等，几乎全为AML，另还可见于拓扑异构酶抑制剂治疗后产生的治疗相关性AML。值得注意的是，通常情况下涉及MLL基因重排的白血病恶性程度较高，对常规化疗不敏感，缓解率低，生存期短，是预后不良的标志。

1.8DEK-CANt(6;9)(p23；q34)，是造血系统罕见的随机染色体异常，可在1%的AML中发现。t(6；9)阳性的AML常预后不良，有报道显示DEK-CAN融合蛋白并不能抑制造血祖细胞的分化，因此其致病机制尚不清楚，还有待进一步的研究[13]。

1.9其他融合基因除上述几种融合基因外，近年来尚有许多新的融合基因型不断被发现，如AML1/MTG8、SET-CAN、TEL-PDGFR、TLS-ERG、AML1-MDS1(EVI-1)等[14]，它们均将成为白血病诊断、预后及MRD诊断的重要分子生物学标志。此外，一些正常核型急性髓性白血病发生的功能性基因突变，如flt3-itd/tkd[15]、C-kit[16]、mll-ptd[17]、npm1[18]等分子特征的发现，也为患者个体化治疗提供了丰富的分子靶点。

2主要检测技术

最初，白血病在分子遗传学领域的主要检测方法为染色体显带技术，它可检测出染色体数目和结构异常的改变，如缺失、重复、插入、倒位和易位等，但其操作复杂且耗时，过程涉及的细节较多，对技术人员要求较高[19]。此外，它对监测白血病患者的MRD方面效果也较差，这些都限制了其在白血病检测中的应用。

随着人们逐渐认识到MRD检测在白血病复发和对白血病指导治疗中的重要性，迫切需要能够高特异性和高灵敏度检测融合基因的方法[20]。近年来，研究人员们分别利用荧光原位杂交、免疫印迹、聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)、流式细胞术(flow cytometric，FCM)、基因芯片及全基因组测序等方法对白血病融合基因进行了研究。现将这些主要检测方法介绍如下。

2.1荧光原位杂交荧光原位杂交是一种通过标记了荧光素的DNA按照碱基互补原则与待检DNA进行杂交后，利用出现的荧光信号的数量和位置来反映标本中存在的相应特异性基因的数量和位置的方法，利用该技术对白血病预后相关基因的检测结果已作为白血病危险度分层的参考指标[21]。它对处于分裂期和分裂间期的细胞均可以进行检测，具有形象直观、灵敏度高、特异性强、无放射性、可进行多重染色等优点，且适用于血液、骨髓、组织等多种临床标本的检测。但由于该方法实验步骤繁杂，过程中影响因素(溶液pH值、温度时间等)较多，使荧光原位杂交在临床的应用有一定局限性。

2.2免疫印迹该法是应用最广泛的实验室技术之一，它首先利用聚丙烯酰胺凝胶电泳将蛋白质样品进行分离，再将其转移至固相载体(如硝酸纤维素薄膜)上，以目的蛋白或多肽作为抗原，与相应抗体即第一抗体发生抗原抗体反应，然后再与酶标记的第二抗体进行免疫反应，经过底物显色来检测目的基因表达的蛋白成分。如国内白颖等[22]利用该法分别检测了AML患者和正常人骨髓中DICER1融合基因的表达，发现DICER1基因在AML中的表达水平明显高于正常对照组，其高表达可能是AML的不良预后因素。但该法实验环境条件要求高，现仍主要用于科研活动中，在临床中应用较少。

2.3PCRPCR技术是一种特异耐热酶(Taq DNA聚合酶)催化下完成的链式反应，主要由高温变性、低温退火和适温延伸3个步骤反复的循环构成。其基本原理是用寡聚核苷酸引物结合在模板DNA(或靶DNA)分子上进行特异核苷酸序列扩增。PCR是检测白血病相关融合基因较为有效且敏感的方法，已应用于白血病相关融合基因的PCR方法主要包括以下几种。

2.3.1逆转录PCR(reverse transcription PCR,RT-PCR)它先以标本中提取得到的信使RNA为模板逆转录出互补DNA，再以互补DNA为模板通过PCR进行扩增，是在RNA水平上检测融合基因的方法。丁凯等[23]应用RT-PCR方法检测了急性白血病患者和健康者骨髓中PRAME基因的信使RNA表达水平，并与患者临床资料行相关性分析后发现PRAME基因在急性白血病中表达率较高，可用于MRD的监测。但由于RT-PCR是一种定性实验，不能对融合基因进行定量，目前已经被下述几种PCR方法取代。

2.3.2实时定量荧光PCR(realtime quantity PCR,RQ-PCR)该方法是在PCR反应体系中加入荧光物质，通过实时检测荧光信号在PCR过程中的累积变化，利用已知浓度的标准品制作的标准曲线对未知浓度的样品进行定量分析的方法，它可以直接检测目的基因的起始数量，从而动态监测融合基因水平。该方法具有快速简便、灵敏度高、重复性好、可准确定量等优点，技术已较为成熟，被广泛应用于临床检测。黄赛等[24]使用RQ-PCR方法对433例初治AML患者中11例MLL-AF9融合基因阳性患者的表达水平进行了检测分析，结果显示，RQ-PCR检测MLL-AF9融合基因可以反映患者MRD的动态变化，与患者的临床预后存在内在相关性，是检测预后的良好指标，同时RQ-PCR可能有早期检测分子生物学复发的潜力。RQ-PCR法可检出1×106个有核细胞中的一个白血病细胞，比传统的细胞学方法及临床症状出现早5～8个月，是现在临床上应用最广、最多的方法。

2.3.3多重逆转录PCR(multiplex reverse transcription PCR，M-RT-PCR)该法又称复合PCR或多重引物PCR，它的反应原理和操作过程跟普通PCR相同，不同点在于它是在同一PCR反应体系里加上两对或多对引物，分别扩增不同的目的片段，从而同时获得多个核酸片段。该法在保留了普通PCR方法的高敏感性和高特异性的基础上，极大地缩短了实验时间，提高了检测效率。姜孟孟等[25]应用多重巢式RT-PCR方法检测了168例初治AML患者的骨髓标本AML融合基因，结果表明有18例出现AML1融合基因，其中AML1-ETO、AML1-EV11、AML1-MDS1、AML1-MTG16、AML1-PRDM16、AML1-CLCA2阳性率依次为7.14%、1.19%、0.6%、0.6%、0.6%、0.6%。该法经济实用，检测快速，在临床应用率也较高。但是，由于其仅能检测已知的基因异常，而对未知的染色体易位和数量异常等无法识别，且样本间易存在交叉污染等使其有一定的局限性。

2.4FCMFCM是对悬液中的单细胞或其他生物粒子通过检测标记的荧光信号，实现高速、逐一的细胞定量分析和分选的技术[26]。该法具有客观、准确、重复性好、可定量的特点，能快速地对大量细胞逐个进行多参数的测定和分析，还可对细胞进行分选，目前被广泛应用于血液学、免疫学、肿瘤学、遗传学、细胞生物学、微生物学等方面，是目前最热门的科学研究方法之一。

近年来该法在检测白血病的免疫分型及白血病患者MRD等方面应用逐渐增多，它主要利用白血病细胞与正常细胞的免疫表型特征的差异，对白血病细胞及MRD进行检测。有研究者对139例异基因造血干细胞移植后的急性淋巴细胞白血病患者，运用四色FCM评估其MRD监测的预后价值，发现移植后FCM阳性的患者同FCM阴性患者相比，前者具有较低的无事件生存率和较高的累积复发发生率[27]。目前白血病免疫分型已成为WHO有关血液系统恶性疾病诊断标准的主要内容，在欧美发达国家更是作为临床血液系统肿瘤诊断与疗效检测不可缺少的依据。

但该方法在实际应用时存在一定的缺陷，如一些化疗后的非恶性淋巴细胞前体细胞因与白血病淋巴细胞具有相似性而容易被误认，导致假阳性的发生，且敏感性方面也远不如PCR技术等。

2.5基因芯片技术基因芯片技术指将大量探针分子固定于支持物表面，再与标记的样品分子进行杂交，通过检测各个探针分子的杂交信号强度获取样品分子的数量和序列信息的方法。该方法具有快速、简便、分辨率高、高通量等优点，可以通过设计不同的探针阵列一次性对样品大量序列进行多项检测和分析，此外还可用于突变基因的检测和发现。早在1999年，Gulob等[28]已研制出用于白血病分型的基因芯片，近年来，应用基因芯片技术进行白血病的转录基因表达谱研究报道较多，但用于临床诊断的基因芯片尚未问世，仍处于研究探索阶段。

2.6全基因组测序全基因组测序即对一种生物的基因组中的全部基因进行测序，测定其DNA的碱基序列。全基因组测序覆盖面广，能检测个体基因组中的全部遗传信息；准确性高，其准确度可高达99.99%，多应用于科研，尚未常规应用于临床诊断[29]。Welch等[30]为确定全基因组测序是否可以识别基因突变，对1例带有无致病性x-RARA融合基因的APL患者进行末端配对测序方法检测，发现了经典的br3 PML-RARA融合基因，说明全基因组测序是突变检测通用的稳定的平台。

3小结

白血病作为一种造血细胞克隆性疾病，细胞遗传学改变在其发生、发展中起着重要作用。一方面，由于携带相同融合基因的患者在诊断和治疗上存在一定的同质性以及预后的可比性，融合基因检测被广泛地应用于白血病的诊断分型及疗效观察。另一方面，监测融合基因表达量还有助于临床医师进一步在分子水平上确定白血病患者治疗后是否获得完全缓解，以便及时调整治疗方案，减轻患者的痛苦和经济负担。此外，定期检测MRD患者体内融合基因表达水平，可更早预测白血病的复发，指导临床治疗，根据融合基因表达水平的多少，决定是否继续化疗，有利于评价治疗效果，预测复发。综上，检测融合基因的方法虽种类多样，但其各有优缺点，为了取得较好的检测结果，常常还是需要联合使用几种检测方法。相信随着分子生物学的飞速发展和新的融合基因的不断发现，白血病的诊断和分型将进入一个崭新的阶段，同时利用分子生物学方法对融合基因进行深入研究，如寻找白血病融合基因相关作用靶标、研究靶向治疗药物等，将为白血病的个性化治疗提供更加有力的支持。

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Advances in Leukemia Fusion Gene and the Detection TechnologyXIAOHeng,LIShou-xia.(ClinicalLaboratoryofHandanCentralHospital,Handan056001,China)

Abstract：Leukemia is a kind of hyperplastic disease of abnormal hematopoietic stem cell cloning,and the main clinical manifestation is the proliferation and abnormal differentiation of leukemia cells in bone marrow and peripheral blood,which is associated with the formation of fusion gene.So far the discovered fusion genes mainly inlcude BCR-ABL,PML-RARA,AML1-ETO,CBFβ-MYH11,TEL/AML1,E2A/PBX1,MLL rearrangement genes and DEK-CAN,which are of great significance for the diagnosis and treatment of leukemia.Detection methods of fusion genes mainly include fluorescence in situ hybridization,Western Blot,polymerase chain reaction,flow cytometric,gene chip and whole genome sequencing method.

Key words：Leukemia; Fusion gene; Detection method

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收稿日期：2015-02-25修回日期：2015-04-27编辑：相丹峰

doi：10.3969/j.issn.1006-2084.2015.22.037

中图分类号：R733.7

文献标识码：A