MALDI-TOF MS在感染性疾病诊断中的应用

陈世敏(综述)，胡成进(审校)

(济南军区总医院实验诊断科，济南 250031)

MALDI-TOF MS在感染性疾病诊断中的应用

陈世敏(综述)，胡成进※(审校)

(济南军区总医院实验诊断科，济南 250031)

摘要：基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)用于临床感染性疾病的诊断具有操作简单、鉴定快速、通量高、灵敏度好、准确性高的优点，已成为目前临床微生物实验室方便快捷的实验技术。该文依据现有文献综述了MALDI-TOF MS在临床感染性疾病诊断中的最新应用，介绍了MALDI-TOF MS用于微生物鉴定的基本原理和现状，以及在抗生素耐药性检测和临床标本直接测试中的应用。

关键词：感染性疾病；基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱；微生物鉴定

临床微生物实验室在给医师提供明确的患者感染信息方面起着至关重要的作用。感染的快速诊断能明显改善患者的预后，尤其是对脓毒症患者，有效抗生素的及时应用能直接降低患者病死率[1]。然而，传统方法和新兴的分子生物学方法在临床微生物检测中都存在局限性。基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrixassisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry,MALDI-TOF MS)是近年发展起来的一种新型软电离质谱技术，对临床感染性疾病中微生物的检测快速、可靠，具有较好的稳定性和可重复性，为微生物的鉴定带来了革命性的变化，已成为目前临床微生物实验室方便快捷的实验技术。该文介绍了MALDI-TOF MS鉴定微生物的工作原理和基本流程，并对MALDI-TOF MS在感染性疾病诊断方面的研究现状和应用前景进行综述。

1MALDI-TOF MS鉴定微生物的工作原理和基本流程

每种微生物都有其自身独特的蛋白质组成，因而拥有独特的蛋白质指纹图谱。MALDI-TOF MS就是通过检测微生物的蛋白质指纹谱图来鉴定微生物。研究表明，MALDI-TOF MS检测的蛋白质指纹图谱主要来自菌株的核糖体蛋白，当然也有其他的高丰富的胞质蛋白(如DNA结合蛋白和冷激蛋白)[2]。MALDI-TOF MS的工作原理和基本流程：将待测微生物样品与基质分别点加在样品板上，溶剂挥发后形成样品与基质的共结晶；检测时质谱仪利用激光作为能量来源轰击结晶体，基质从激光中吸收能量使样品解吸，基质与样品之间发生电荷转移使得样品分子电离，经过飞行时间检测器，采集数据并获得特异性指纹图谱，然后通过相应的数据库软件，自动匹配待测菌株的图谱至参考数据库的已知菌株图谱从而得到鉴定结果[3]。目前临床微生物实验室中应用较多的质谱仪主要是德国布鲁克公司和法国梅里埃公司的产品。MALDI-TOF MS检测到的菌株蛋白质指纹图谱一般不会与数据库中的已知菌株图谱完全相同，针对此种情况，布鲁克公司的质谱仪和梅里埃公司的质谱仪分别以“score value” 和“confidence value”来表示待测菌株与数据库中参考图谱匹配的相似度。MALDI-TOF MS对菌株的鉴定严重依赖于所用数据库的质量和准确性。

2MALDI-TOF MS的细菌鉴定性能

2.1临床常见分离菌株MALDI-TOF MS对临床分离菌株的鉴定明显优于传统的微生物鉴定技术。Saffert等[4]对比分析了440株临床革兰阴性杆菌分离株，结果显示，MALDI-TOF MS准确鉴定至微生物属和种的结果分别为93%和82%，而自动生化鉴定仪的正确识别率仅为83%和75%。McElvania Tekippe等[5]通过MALDI-TOF MS分析了临床分离获得的239株需氧革兰阳性菌株，结果显示，鉴定到微生物属和种的水平分别达92%和76%。Schulthess等[6]评估革兰阳性杆菌的鉴定情况，显示190株细菌中能直接菌株克隆鉴定的占72%，甲酸提取后能使准确鉴定结果提高至87%。Richter等[7]报道，对于临床常见肠杆菌科细菌的鉴定97%能达到属的水平，84%的细菌能鉴定至种的水平；对于非肠杆菌科革兰阴性杆菌的鉴定分别为91%和78%。Garner等[8]报道，对于部分传统方法不能鉴定的菌株，MALDI-TOF MS可以给出准确鉴定。而且，在MALDI-TOF MS获得的鉴定结果与传统方法的鉴定结果不一致时，16S rDNA序列分析验证结果大多支持MALDI TOF MS的鉴定(75.0%～78.3%)；另外， MALDI-TOF MS鉴定菌株在菌属水平的错误率仅为0.1%，而传统方法的错误率高达1.6%；而且因MALDI-TOF MS采集的优势峰主要由2000～20 000的核糖体蛋白质组成，所以MALDI-TOF MS鉴定菌株的性能不受培养基、培养条件、培养时间的影响，而且具有高度重复性[9-11]。

2.2厌氧菌MALDI-TOF MS鉴定细菌的优势不仅体现在临床常见需氧菌的鉴定上，对厌氧菌的鉴定已经成为替代16S RNA和气液相色谱法的检测方法。一直以来，许多临床微生物实验室还不具有检测厌氧菌的能力，MALDI-TOF MS使临床厌氧菌感染的诊断成为可能。Barreau等[12]通过布鲁克的MALDI Biotyper评估了1325株厌氧菌，鉴定到菌属和种水平的比例分别高达100%和93%。Garner等[8]采用VITEK MS系统评估651株厌氧菌，鉴定结果分别为93%鉴定到菌属，91%鉴定到菌种。

2.3分枝杆菌与厌氧菌的鉴定一样，临床微生物实验室在进行分枝杆菌的鉴定时也面临挑战。以前常用的鉴定方法有生化反应测试法、DNA探针法、高效液相色谱法以及测序法等，目前，MALDI-TOF MS被认为是鉴定分枝杆菌的有效工具。MALDI-TOF MS鉴定分枝杆菌需要经过特殊处理，Balada-Llasat等[13]评估了178株生长在培养基中的分枝杆菌，按照布鲁克公司推荐方法，先是加热灭活，再乙醇处理并机械粉碎，最后鉴定结果是98%鉴定到菌属，94%鉴定到菌种。Mather等[14]则比较分析了布鲁克公司的MALDI Biotyper系统和梅里埃的Vitek MS RUO平台，198株临床分离菌株中95%的分枝杆菌可通过Biotyper系统及其扩展数据库得到鉴定，94%的菌株可在Vitek MS RUO平台得到正确鉴定。

3MALDI-TOF MS的真菌鉴定性能

免疫功能低下的患者在侵袭性治疗后真菌感染风险增加，但可以出现非特异性感染的症状和体征。有证据表明，抗真菌治疗延迟与病死率升高密切相关[15-16]，因此导致感染真菌的快速识别是医师采取适当治疗措施的关键。因不同菌株对抗真菌药物的天然耐药性存在明显差异(如克柔假丝酵母菌对氟康唑天然耐药，而葡萄牙假丝酵母菌则对两性霉素B具有天然耐药性)，所以真菌菌株的快速鉴定势在必行。现行情况下真菌鉴定严重滞后，尤其是丝状真菌的鉴定，主要依赖于显微镜检体外增殖产生的形态结构，然而这些特征结构的形成不但需要漫长的过程，而且也不是一定能发生的。在没有附加的基于分子水平的检测时，该分离株的鉴定只能描述为“丝状真菌”，再没有任何详细的信息提供给临床医师。MALDI-TOF MS鉴定酵母样真菌和丝状真菌的研究已有多个报道，相比于细菌的鉴定，鉴定真菌时需要对待测样本进行裂解、蛋白提取等处理。目前，常用的简单操作程序是涂布样本后覆盖适量甲酸，室温干燥后再覆盖基质进行检测，对于大部分临床酵母样真菌的鉴定完全可行[17]。Dhiman等[18]在对包括念珠菌属、隐球菌属、红酵母菌属和酿酒酵母菌属在内的241株酵母菌进行MALDI-TOF MS分析时，92%的菌株能鉴定到种的水平。重要的是， MALDI-TOF MS对克柔念珠菌和都柏林念珠菌的鉴定明显优于传统鉴定方法。Bader等[19]通过对包含36种菌属的1192株酵母菌的鉴定比对了布鲁克的MALDI Biotyper系统和梅里埃的VITEK MS系统，结果显示，两者均能成功鉴定传统方法不能区分的亲缘关系较近的菌属。与细菌分离株的鉴定一样，MALDI-TOF MS鉴定错误或不能鉴定酵母菌的常见原因是数据库中相应菌株参考图谱的缺失。

最近，陆续出现了临床使用MALDI-TOF MS鉴定霉菌菌株的评估报道。丝状真菌的鉴定受限于参考数据库覆盖菌株的深度和广度。然而，随着数据库的适当开发，MALDI-TOF MS可以成功完成霉菌的鉴定。有报道，临床相关曲霉菌数据库的建立，已使临床分离株的鉴定准确到种的水平，而且不受待测菌成熟度的影响[20]。对于在目前可用参考数据库鉴定结果表现较差的情况下，需要大家不断地将临床相关分离株图谱补充到商业数据库中。De Carolis等[21]前瞻性地分析了103株临床分离的黑曲霉、镰刀菌和毛霉菌，并利用培养收集菌株创建了相应的参考数据库。Alshawa等[22]创建了一个包含12种临床相关皮肤癣菌属50个参考图谱的数据库，通过这个数据库可以正确鉴定临床91.9%的皮肤癣菌。虽然MALDI-TOF MS在霉菌的鉴定上显示了巨大潜力，但是临床实验室常规鉴定霉菌仍处于起步阶段。

4MALDI-TOF MS检测抗菌素耐药性

抗生素耐药是感染性疾病患者发病和死亡的重要原因。据估计，仅在美国每年超过70%的医院获得性感染是由微生物的耐药性造成的[23]。因此，快速、准确地检测抗生素耐药性对患者的管理和感染的预防是非常重要的。MALDI-TOF MS成功显示出微生物鉴定方面的强大威力后，该方法用于检测抗生素耐药性的潜在应用就成为研究热点。现有数据表明，对于革兰阳性菌，MALDI-TOF MS能够鉴别耐甲氧西林金黄色葡萄球菌菌株[24]及万古霉素耐药的肠球菌[25]。对于革兰阴性菌药物敏感性的研究主要针对β内酰胺酶类抗生素，具体而言，MALDI-TOF MS能够区分产超广谱β内酰胺酶和金属-β内酰胺酶的大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌和铜绿假单胞菌[26]。MALDI-TOF MS检测抗生素耐药性的原理是抗生素、细菌混合孵育过程中产酶菌株具有水解抗生素的能力，可导致待测抗生素特定峰强度的改变。关于耐药性的检测MALDI-TOF MS获得结果与常规药敏方法所得结果相关性很好[27]。后续的研究表明，水解试验加MALDI-TOF MS在检测碳青霉烯酶方面也是功能强大、快速低廉的方法；虽然这种方法的敏感度接近100%，检测时间可缩短至1～2.5 h[28-30]，但是这种技术方法用于临床常规检测还有待进一步验证。

5MALDI-TOF MS的应用前景

5.1快速鉴定MALDI-TOF MS不仅在微生物鉴定的准确性方面优于传统的鉴定方法，更吸引人的是利用MALDI-TOF MS鉴定微生物比传统鉴定方法能明显改进样本的周转时间。2009年，Seng等[31]首先报道，MALDI-TOF MS鉴定一个给定菌株仅需6～8.5 min，而常规鉴定则需要5～48 h。Cherkaoui等[32]报道，MALDI-TOF MS批量鉴定10株菌的时间不足15 min。随后，又有报道指出，鉴定952株菌株的平均时间比传统方法缩短1.45 d[33]。MALDI-TOF MS使样本检测周转时间的大幅缩短无疑是临床感染性疾病快速诊断的福音。

5.2阳性血培养标本的直接鉴定MALDI-TOF MS在临床微生物感染检测中最令人兴奋的是使临床标本的直接鉴定成为可能且具有美好的应用前景。对阳性血培养瓶中菌株的直接鉴定一直是大家的研究关注点。目前的研究报道，大多数MALDI-TOF MS方法能快速鉴定出单种微生物感染的阳性血培养而且有较高的阳性预测值；MALDI-TOF MS直接鉴定阳性血培养菌株，须进行样本的预处理消除培养基中血细胞和各种营养成分的干扰，样品的制备和鉴定大约需1 h；即便如此，因免除了分离菌株的培养，仍能保证病原菌的鉴定时间比传统方法至少缩短周转时间24 h以上[34-35]。然而，MALDI-TOF MS直接鉴定血培养阳性瓶的局限性是无法可靠地确定多种微生物感染。

5.3尿液标本的直接鉴定MALDI-TOF MS用于临床尿液标本直接细菌鉴定也有报道。尿路感染患者的尿液标本在MALDI-TOF MS分析时，只需差速离心去除白细胞和其他非细菌性尿液成分即可进行鉴定。Kohling等[36]报道，MALDI-TOF MS完成整个尿液标本的检测过程(包括样品制备)仅需30 min。由于临床尿液标本的直接检测不仅存在多种细菌问题，还有标本中细菌含量问题，所以目前大多数临床微生物实验室还不能实现尿液标本中微生物的直接鉴定，但是现有研究结果表明了该方法在未来经过适当的优化后的潜力。

5.4流行病学和预防感染方面近年来，MALDI-TOF MS在流行病学和预防感染方面的应用也越来越多。现有的MALDI-TOF MS操作软件包含分类功能，众多研究涉及到用MALDI-TOF MS方法对耐甲氧西林葡萄球菌和产单核李斯特菌的分类、耐万古霉素肠球菌相关的流行病学检测、结膜炎爆发期间肺炎链球菌分离株的分型、沙门菌和小肠结肠炎耶尔森菌的快速亚种测定等。

6小结

MALDI-TOF MS在临床微生物学实验室的应用不仅可以明显缩短样本检测周期，而且具有自动化、高通量、测试费用低的特点，且与现有的常规检测方法相比其结果准确、重复性好，对常规方法难以鉴定的部分病原微生物也能进行检测。当然，MALDI-TOF MS也有其局限性，首先是仪器本身购置费用昂贵，中小规模的实验室目前还难以承受；其次对于个别微生物的鉴定还有待于进一步的改进[37]。相信随着数据库的逐步完善、现有问题的逐步解决，MALDI-TOF MS在临床微生物领域的应用将更加普及。

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Application of MALDI-TOF MS in the Diagnosis of Infectious DiseasesCHENShi-min，HUCheng-jin.(DepartmentofClinicalLaboratory,GeneralHospitalofJinanMilitaryRegion,Jinan250031，China)

Abstract:Matrixassisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry(MALDI-TOF MS)has the advantages of simple operation,rapid identification,high throughput,good sensitivity and high accuracy for the diagnosis of clinical infectious diseases.It has become an incontrovertibly convenient and rapid technology for the clinical microbiological laboratory.Here is to make a review of the latest clinical application of MALDI-TOF MS in the diagnosis of infectious diseases.Here is to introduce the basic principle and application status of MALDI-TOF MS in the microorganisms detection,the detection of antimicrobial resistance,and the direct organism identification from clinical specimens.

Key words:Infectious diseases； Matrix assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry； Microorganism identification

收稿日期：2015-01-26修回日期：2015-03-21编辑：郑雪

doi：10.3969/j.issn.1006-2084.2015.22.036

中图分类号：R446.1

文献标识码：A

文章编号：1006-2084(2015)22-4127-04