慢病毒介导的shRNA沉默PTTG基因抑制人PRL型垂体腺瘤细胞生长的体外实验研究的护理方式

广东省从化市妇幼保健院(510900)罗巧灵

大型生长激素(PRL)型垂体腺瘤是一种较为常见的激素分泌性垂体瘤［1］，在此类型中所占的比重约为35%～45%［2］，PRL垂体腺瘤种类中的侵袭性腺瘤具有全切率低、复发率高的特点［3］，成为临床治疗的难点。但是经过医疗科学人员的不懈努力，终于研制出了对抗PRL垂体腺瘤的方式，但是在目前医疗技术水平条件的制约下，手术、放疗、药物等治疗措施仍很难将其彻底根治。经过体外实验研究表明，垂体肿瘤细胞转化基因(PTTG)成为了垂体腺瘤靶向治疗的重要基因之一，近年来成为垂体腺瘤基础研究的热点。

1 资料与方法

1.1 一般资料 慢病毒介导的shRNA沉默PTTG基因抑制人PRL型垂体腺瘤细胞生长的体外实验需要的材料有:培养基、FBS［4］、琼脂糖、绿色荧光蛋白重组载体、pHelper3.0包装系统、LV-NC病毒载体、兔抗鼠PTTG抗体、羊抗兔IgG、预染蛋白、PVDF膜、显色剂、MTT、1.5mlEP管，20～250μL移液器。其中FBS胎牛血清、琼脂糖、羊抗兔IgG、预染蛋白、PVDF膜、显色剂均为国外进口。

1.2 原代培养源 原代培养源主要由从化的1位PRL型垂体腺肿瘤的患者提供，男，年龄42岁，通过手术切除肿瘤标本。对得到的肿瘤标本按照规定进行原代培养试验。

1.3 PTTG-shRNA慢病毒载体的构建 利用short interfering RNA设计工具软件进行设计，合并具有shRNA结构的短发夹序列。干扰序列为5'-aaTACACCTAGTTAACCGACTTGCCAtt-3'，寡核苷酸序列有:1)正义链为5'-CCGAAGTTGAATAGCCTCAGCAGAGCGATCGAGCTTTT-3'。2)反义链为5'-AATGACTAAAATGCGTACATAAGTCGAGTACGCTTAGC AG-3'。

正义链与反义链中均含有酶切位点，形成双链DNA，与酶结合、转化链接，生成pGCSIL-GFD重组载体，联合pHelper3.0质粒后共传染了300T细胞，产生PTTG-shRNA慢病毒载体，病毒载体滴度为4×109TU/mL。

1.4 实验分组以及慢病毒传染的情况 传染前1天将细胞接种在孔板上，分为正常对照组、阴性对照组和观察组。正常对照组不进行任何处理，对阴性对照组进行慢病毒载体传染，观察组进行PTTG-shRNA进行传染。

2 结果

2.1 PTTG-shRNA慢病毒感染的效果 经过慢病毒感染后的细胞在5小时后有绿色荧光现象产生，71小时后更换培养液，继续进行为期2天的培养，流式细胞仪分析后，3组肿瘤细胞的表达率均符合实验的需求。

2.2 3组PTTG基因表达情况 观察组PTTG基因表达为(0.27±0.03)，正常对照组PTTG基因表达为(0.94±0.04)，阴性对照组PTTG基因表达为(0.96±0.06)，基因表达量明显下降，P＜0.05，差异具有显著性。

2.3 3组PTTG蛋白表达情况 观察组PTTG蛋白的表达量为(0.13±0.04)，正常对照组PTTG蛋白的表达量为(0.94±0.06)，阴性对照组PTTG蛋白的表达量为(0.87±0.06)。

2.4 3组传染后细胞生长情况比较 传染71小时后，观察组细胞的生长发育能力、转移扩散能力明显降低，比其他两组抑制细胞生长的能力更强，并且再经24小时后继续观察发现，此结论表现的更为明显。阴性对照组与正常对照组则没有发生癌细胞生长方面情况的变化。

2.5 3组细胞凋亡需要的周期 观察组的垂体肿瘤细胞G0/G1时期细胞凋亡的情况明显，但是在S时期出现降低的现象，从总体上来说给垂体肿瘤患者带来了福音。

2.6 提供垂体腺肿瘤的患者护理情况 从化市提供垂体腺肿瘤的患者经过精心护理后病情得到了较大的好转。术后对患者提供的护理服务有:1)苏醒后的护理方式。在患者苏醒6个小时后需要给床海拔16头，防止静脉回流造成脑部水肿。2)膨胀海绵塞住患者的口腔。在手术24小时后对患者进行鼻腔护理和口腔护理，患者没有发生感染的情况。3)并发症的护理。对于手术后患者高热的不良反应，本次护理中给患者使用了冬眠药物，有效地避免了意识障碍情况的发生。

3 讨论

PTTG是近年来发现的一种新型的原癌基因，在垂体腺瘤靶向治疗中具有极大的潜在价值。从关于人PRL型垂体腺瘤的相关研究中发现，PPTG是一种能够促进癌症细胞生长、扩散，提高吞噬能力的癌症基因［6］，能够使肿瘤周边产生新的血管，加快肿瘤细胞的繁殖速度。裸鼠试验证明，在没有其他癌症基因的前提下，PTTG也能够导致裸鼠快速致癌［7］。

通过本次实验发现，PTTG基因的突变能够消除其对正常细胞的恶性影响［8］，具有抑制人PRL型垂体腺瘤细胞扩散的作用，成为生物治疗重点研究的课题，是当今医学界最为热门的靶点之一［9］。

本次研究中，利用了shRNA技术进行干扰，下调PTTG基因中蛋白的表达，设立正常对照组和阴性对照组，观察经过干预后癌细胞增殖和凋亡的情况，系统地分析慢病毒介导的shRNA沉默PTTG基因抑制人PRL型垂体腺瘤细胞生长的作用。结果表明，PTTG病毒载体对垂体细胞的传染可高达97%以上，且观察组PPTGmRNA表达比正常对照组和阴性对照组更趋于正常状况，下降较为明显。另外，观察组肿瘤细胞的生长能力出现滑坡的趋势，对垂体肿瘤细胞的抑制效果更为明显，凋亡率显著提高。但是，PPTG诱导肿瘤细胞死亡的原理目前并不是非常明确，需要进一步进行求证。

由实际病例的护理方式得到了良好的效果和上述实验中的启示，可以得知在护理中需要注重的问题。1)严密检测病情的发展情况。密切注重PTTG蛋白表达情况，发现异常情况立刻采取相关的措施控制病情。2)在做好基本护理的同时需要对患者进行心理疏导。在患者得知自己的病情经过手术、放疗、药物等治疗措施仍很难将其彻底根治这一基本情况时，会产生恐惧、忧虑的心理，因此需要对患者进行心理干预，减少不良的心理状态对患者的影响，帮助患者用积极的心态迎接病魔的挑战。

综上所述，慢病毒介导的shRNA沉默PTTG能够抑制人PRL型垂体腺瘤细胞的生长，消除PTTG基因的恶性影响［10］，抑制癌细胞的扩散，降低PPTGmRNA和蛋白表达水平，提高癌症细胞的凋亡率，为垂体腺瘤的生物治疗探索有效的治疗途径，具有极强的医学价值，值得推广。

［1］沈云龙，崔玉婷，朱剑峰，等.慢病毒介导的shRNA沉默PTTG基因表达对人生长激素型垂体腺瘤细胞生长的影响［J］.中国微侵袭神经外科杂志，2012，8:376

［2］沈云龙，崔玉婷，朱建峰，等.PTTG基因siRNA载体的构建与鉴定［J］.解剖学研究，2012，4:280

［3］范胜强.RNAi沉默PTTG对大鼠垂体腺瘤细胞CD147、MMP-9表达的影响［D］.山东大学，2012

［4］曹中喆.PI3K/Akt/mTOR及其下游通路在PRL垂体腺瘤中的表达及意义［D］.河北医科大学，2013

［5］蔡锋.TGFβ1/Smad-SDF-1α/CXCR4在成纤维细胞-垂体腺瘤细胞相互作用中的机制研究［D］.北京协和医学院，2013

［6］莫小亮.HPV16E6和hTERT在宫颈癌致癌机制中的作用研究［D］.广西医科大学，2014

［7］孙帅奇.100例垂体腺瘤患者的临床回顾分析［D］.桂林医学院，2013

［8］李妍，杜红延，李红卫.慢病毒载体及其在RNA干扰技术中的应用与发展［J］.分子诊断与治疗杂志，2013，1:55

［9］陈其钻，陈谦学.垂体腺瘤治疗现状和进展［J］.中国临床神经外科杂志，2013，6:381

［10］彭冬先，何援利，丘立文.慢病毒介导靶向survivin基因的shRNA对裸鼠子宫内膜异位病灶生长的影响［J］.现代妇产科进展，2013，9:704