七氟醚预处理对大鼠心肌缺血再灌注的影响与Caveolin-3 表达的关系

郝丽兵，焦丽媛，赵建力

(山西医科大学， 山西 太原　030001)



七氟醚预处理对大鼠心肌缺血再灌注的影响与Caveolin-3 表达的关系

郝丽兵，焦丽媛，赵建力*

(山西医科大学， 山西 太原030001)

[摘要]目的：评价不同浓度及不同给药模式七氟醚预处理对大鼠心肌缺血再灌注的影响及Caveolin-3在其中的作用。方法：采集健康雄性Wistar大鼠，使用改良Langedorff灌注装置制备离体心脏灌注模型，将其均分为6组(n=10)：对照组(C组)、缺血再灌注组(IR组)、持续1.5%七氟醚预处理组(APC-1)、持续2.5%七氟醚预处理组(APC-2)、间断1.5%七氟醚预处理组(APCI-1)和间断2.5%七氟醚预处理组(APCI-2)。采用氯化三苯基四氮唑染色法评价离体心脏缺血再灌注损伤梗死面积，取左心室心肌细胞测定Caveolin-3的表达。结果：与对照组相比，缺血再灌注组心肌梗死面积增大，Caveolin-3表达下降，差异有统计学意义(P<0.05)。与缺血再灌注组相比，七氟醚预处理组心肌梗死面积减小，Caveolin-3表达上调，差异有统计学意义(P<0.05)。不同浓度及给药模式的七氟醚预处理组间相比，持续给药模式较间断给药模式组心肌缺血再灌注梗死面积减小，Caveolin-3表达上调最明显，差别有统计学意义(P<0.05)，而不同浓度七氟醚组间心肌梗死面积、Caveolin-3表达无统计学意义(P>0.05)。结论：七氟醚预处理能减轻大鼠心肌缺血再灌注损伤，缩小梗死面积；持续七氟醚预处理具有明显的心肌保护作用其作用机制可能与上调Caveolin-3的表达有关。

[关键词]七氟醚；心肌缺血再灌注损伤；缺血预处理； Caveolin-3

Effects of Sevoflurane Preconditioning on Myocardial Cells during Myocardial Ischemia-reperfusion in Rats and the Relationship of the Expression of Caveolin-3

HAO Libing, JIAO Liyuan, ZHAO Jianli

(ShanxiMedicalUniversity,Taiyuan030001,Shanxi,China)

[ABSTRACT]Objective: To evaluate the effects of sevoflurane preconditioning with different concentration and different administration model on myocardial cells during myocardial ischemia-reperfusion in rats and the role of Caveolin-3. Methods：The healthy male SD rats were completely randomly assigned to 6 different groups (n=10 each) using a random number table, controlling group(group C)，I/R group, Lasting 1.5% sevoflurane preconditioning group(APC-1), Lasting 2.5% sevoflurane preconditioning group(APC-2), Intermittent 1.5% sevoflurane preconditioning group(APCI-1) and intermittent 2.5% sevoflurane preconditioning group(APCI-2). TTC(Triphenyl tetrazolium chloride) staining evaluated the infarct size of myocardial infarction, and immunohistochemistry evaluated the expression of Caveolin-3 on left ventricle. Results: Compared with the controlling group (group C), myocardial infarction area increased and Caveolin-3 expression decreased in group I/R. There was statistically significant difference(P<0.05). Compared with the group I/R, myocardial infarction area decreased, and Caveolin-3 expression raised in Sevoflurane preconditioning group. There was statistically significant difference(P<0.05). In different sevoflurane preconditioning group, myocardial infarction size decreased, and Caveolin-3 expression raised. There was statistically significant difference in last sevoflurane preconditioning group compared with intermittent sevoflurane preconditioning group(P<0.05). But myocardial infarction area and Caveolin-3 expression had no statistical significance in different concentrations of sevoflurane group(P>0.05).Conclusion: Sevoflurane preconditioning can attenuate myocardial ischemia reperfusion injury in rats, possibly associated with upregulated Caveolin-3 expression and narrowing the area of myocardial infarction. The effection of myocardial protection is the most obvious in continuing sevoflurane preconditioning group.

[KEYWORD] sevoflurane；myocardial reperfusion injury；ischemic preconditioning；Caveolin-3

随着冠状动脉旁路移植术、急性心肌梗死溶栓术及体外循环下心内直视手术等临床治疗手段的广泛应用，术中均可能发生心肌缺血再灌注损伤。心肌缺血再灌注损伤是一种常见病理生理过程，涉及多个环节，长时间持续性缺血和再灌注可诱发心肌细胞凋亡，导致心肌细胞不可逆性死亡。已有研究证实，缺血预处理是最有效的心肌保护方法之一[1]，而七氟醚可发挥与缺血预处理相似的心肌保护效应。这为临床心脏病人行心脏或非心脏手术时麻醉方案的选择提供了理论依据。Caveolin-3是一种重要的膜结构蛋白和调节蛋白，可特异性地表达于心肌细胞，在维持细胞正常运转以及信息传导中起着重要作用，心肌研究提示它与心肌发育、营养和能量代谢密切相关[2-4]。本研究拟探讨不同浓度及不同给药模式七氟醚预处理对大鼠缺血再灌注心肌细胞的影响及Caveolin-3在其中的作用。

1材料和方法

1.1主要试剂与仪器

七氟醚(上海恒瑞医药股份有限公司)，K-H液(mmol/L：NaCl 118．5、NaHC0325.0、KCl 4．75、MgS041.2、KH2P041.2、CaCl22.5、葡萄糖1.11)，Caveolin-3单克隆抗体(Santa Cruz公司，美国)，七氟醚挥发罐(Dmger公司，德国)，麻醉气体监测仪(Dmger Vamos公司，德国)，TTC染料(Amrecro公司)。

1.2动物选择与模型制备

SPF级健康雄性Wistar大鼠60只，6～8周龄，体重280～360 g，由山西医科大学实验动物中心提供。适应性饲养3 d后，腹腔注射戊巴比妥钠30 mg/kg麻醉，腹腔注射肝素1 000 IU/kg抗凝，迅速开胸取出心脏，放入4℃ K-H液中，修剪心脏周围组织，轻轻挤压心脏，洗清残留血液，悬挂于Langendofff离体灌注装置上固定。用37℃、95%O2和5%CO2混合气体，持续充气平衡30 min的K-H液灌注30 min，pH值7.35～7.45，灌注压90 cm H2O(1 cm H2O=0.098 kPa)。

1.3实验分组和处理

离体心脏60个，采用随机数字表法，均分为6组(n=10)：对照组(C组)、缺血再灌注组(IR组)、持续1.5%七氟醚预处理组(APC-1)、持续2.5%七氟醚预处理组(APC-2)、间断1.5%七氟醚预处理组(APCI-1)和间断2.5%七氟醚预处理组(APCI-2)。C组继续灌注K-H液90 min；IR行全心缺血30 min，再灌注60 min；持续1.5%七氟醚预处理组(APC-1)通过七氟醚挥发罐将1.5%七氟醚持续吹入K-H液中，用预充1.5%七氟醚的K-H液灌注15 min，之后行全心缺血30 min，再灌注60 min；持续2.5%七氟醚预处理组(APC-2)处理方法同APC-1；间断1.5%七氟醚预处理组(APCI-1)通过七氟醚挥发罐将1.5%七氟醚持续吹入K-H液中，用预充1.5%七氟醚的K-H液灌注5 min，然后用K-H液灌注5 min，再次恢复含七氟醚的K-H灌注5 min，共计15 min，之后行全心缺血30 min，再灌注60 min；间断2.5%七氟醚预处理组(APCI-2)处理方法同APCI-1。采用麻醉气体监测仪监测七氟醚浓度。

1.4观察指标

1.4.1离体心肌缺血再灌注梗死面积灌流结束后，每组随机取5只，取下心脏，取刀片垂直心脏长轴将其横切为5片，每片约为2 mm。展平后置于PBS(0.1 mol/L)溶解的1%TTC溶液中，37℃避光孵育20 min，取出后置于10%中性甲醛(0.1 mol/L PBS配制)中。于染色后l周对4个横切片的正反两面进行图像采集[5]，照片采用Photoshop 3S Extended软件计算梗死面积。梗死面积百分比(%)=梗死面积/横切片总面积×100%。

1.4.2免疫组化检测Caveolin-3表达取左心室心肌组织，多聚甲醛固定，石蜡包埋切片，脱蜡，山羊血清封闭，滴加Caveolin-3单克隆抗体(稀释度1∶100)，4℃孵育过夜；滴加辣根过氧化物酶标记的大鼠IgG抗体(稀释度1∶10 000)，37℃孵育30 min；DAB显色，苏木精复染。显微镜下观察呈棕黄色染色为阳性，应用Image-Pro Plus图像分析系统测定光密度值，反映Caveolin-3的表达[6]。

1.5统计学方法

2结果

2.1各组大鼠TTC染色心肌缺血再灌注梗死面积比较

与C组相比，IR组心肌梗死面积增大，差异有统计学意义(P<0.05)。与IR组相比，APC-1、APC-2、APCI-1、APCI-2组心肌梗死面积减小，差异有统计学意义(P<0.05)。不同浓度及给药模式的七氟醚预处理组间相比，可见持续给药模式较间断给药模式组心肌缺血再灌注梗死面积减小，差别有统计学意义(P<0.05)，而不同浓度七氟醚组间心肌梗死面积比较无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1　各组大鼠TTC染色心肌缺血再灌注梗死面积比较(±s)%Table 1　Comparison of the Area of Myocardial Infarction in Rats with TTC Staining in Each Group(±s)　%

2.2各组大鼠缺血再灌注心肌免疫组化Caveolin-3表达比较

与C组比较，IR组Caveolin-3表达下调(P<0.05)，差异有统计学意义。与IR组相比，APC-1、APC-2、APCI-1、APCI-2组Caveolin-3表达增加，差别有统计学意义(P<0.05)。不同浓度及给药模式的七氟醚预处理组间相比，持续给药模式较间断给药模式组Caveolin-3表达增高，差别有统计学意义(P<0.05)，而不同浓度七氟醚组间Caveolin-3表达无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2　各组大鼠缺血再灌注心肌Caveolin-3表达%Table 2　The Expression of Caveolin-3 on Myocardial Cells during Myocardial Ischemia-reperfusion in Rats(±s)　　%

3讨论

在心肌缺血再灌注过程中，细胞凋亡是引起损伤的重要病理机制之一 。如何有效抑制心肌缺血所致细胞凋亡的发生和发展，从而促进缺血再灌注心肌功能恢复、减轻心肌致死性损伤，是研究探索的热点。心肌细胞是不可再生细胞，通过表1可见，与对照组相比，缺血再灌注组心肌梗死面积增大，差异有统计学意义(P<0.05)。与缺血再灌注组相比，七氟醚预处理组心肌梗死面积减小，差异有统计学意义(P<0.05)。不同浓度及给药模式的七氟醚预处理组间相比，可见持续给药模式较间断给药模式组心肌缺血再灌注梗死面积减小，差别有统计学意义(P<0.05)，而不同浓度七氟醚组间心肌梗死面积比较无统计学意义(P>0.05)。

窑蛋白是细胞膜上的特异性囊状小凹结构，由脂类(如胆固醇、鞘糖脂和鞘磷脂)和蛋白质组成。窑蛋白能与多种关键信号分子，如G蛋白、Ha-Ras、Src酪氨酸激酶家族成员、EGF受体、胰岛素受体、PKC、eNOS，对其活性起负性调控作用，从而参与细胞分化、增殖、肿瘤发生、炎症和细胞衰老等病理生理过程。窑蛋白可分为3种亚型，其中Caveolin-3于1996年首次鉴定，并发现高水平Caveolin-3仅存在于骨骼肌和心肌的微囊和T管，暗示微囊蛋白在肌细胞中有特殊作用,被认为是Caveolin参与心脏的缺血再灌注损伤保护作用的重要成分,Caveolin-3的作用通路已有初步研究，但具体机制尚未完全阐明。Caveolin-3可以通过与Ca2+-ATPase、G蛋白α亚单位、eNOS、Ras及上皮生长因子受体等的共同特异序列结合后，能抑制它们的活性，因此成为一个心脏的缺血再灌注保护作用研究的新治疗靶点。通过表2可见，与对照组比较，缺血再灌注组Caveolin-3表达减少，差别有统计学意义(P<0.05)。与缺血再灌注组相比，七氟醚预处理组Caveolin-3表达增加，差别有统计学意义(P<0.05)。不同浓度及给药模式的七氟醚预处理组间相比，持续给药模式较间断给药模式组Caveolin-3表达增高，差别有统计学意义(P<0.05)，而不同浓度七氟醚组间Caveolin-3表达无统计学意义(P>0.05)。通过表1和表2可以看出，Caveolin-3表达增高时，心肌细胞缺血再灌注时心肌梗死面积减小。提示七氟醚预处理减轻大鼠心肌缺血再灌注损伤的机制可能与上调Caveolin-3的表达有关。而七氟醚如何通过上调Caveolin-3表达而减轻心肌细胞梗死有待进一步研究。

[参考文献]

[1]朱俊超,兰培丽,李阳.七氟醚预先给药对大鼠心肌缺血再灌注损伤时胱硫醚-合酶和血红素氧合酶-1表达的影响[J].中华麻醉学杂志，2012,32(5)：600-603.

[2]Tang Z，Scherer PE，Okamoto T，etal．Molecular Cloning of Caveolin-3，a Novel Member of the Caveolin Gene Family Expressed Predominantly In Muscle[J]．J Biol Chem，1996，271(4)：2255-2261．

[3]Williams TM，Lisanti MP．The Caveolinproteins[J]．Genome Biol，2004，5(3)：214.

[4]黄勤,王庭槐.心肌细胞caveolin-3的相关信号转导[J].国际病理科学与临床杂志，2005,25(4)：297-299.

[5]王燕,胡慧媛,赵美眯,等.TTC染色评价豚鼠离体心脏缺血/再灌注损伤梗死面积的适宜观察时间及计算方法[J].中国医科大学学报,2013,42(2):160-164.

[6]张彦清，赵建力，刘保江.七氟醚预处理对大鼠心肌缺血再灌注时窑蛋白-3表达的影响[J].中华麻醉学杂志，2014,34(1)：79-81.

本文编辑：王知平

[通讯作者]赵建力，男，副教授， E-mail：haolibing8@163.com

[作者简介]郝丽兵，男，主治医师，麻醉学硕士研究生在读

[中图分类号]R654.2

[文献标识码]A

[文章编号]1671-0126(2015)02-0003-04