少棘蜈蚣候选杀虫肽κ－SLPTX－Ssm2b的原核表达与纯化

赵丹，刘长军，吴磊

（国防科学技术大学理学院生物信息研究中心，湖南长沙410073）

少棘蜈蚣候选杀虫肽κ－SLPTX－Ssm2b的原核表达与纯化

赵丹，刘长军，吴磊*

（国防科学技术大学理学院生物信息研究中心，湖南长沙410073）

通过搜索NCBI数据库，获得了与具有昆虫毒性的少棘蜈蚣毒素κ－SLPTX－Ssm2a高度同源的毒素分子κ－SLPTX－Ssm2b.通过密码子优化并全基因合成获得了其DNA序列，利用RF－cloning技术将κ－SLPTX－Ssm2b插入到表达载体pet－HIS－SUMO，通过自动诱导表达技术在大肠杆菌BL21（DE3）诱导融合蛋白表达，通过镍柱纯化并用Ulp1激酶切割sumo标签并释放毒素分子，通过MALDI－TOF质谱鉴定其分子量为3 390.4658 Da.研究结果表明获得了与理论分子量（3391.04 Da）一致的κ－SLPTX－Ssm2b目的毒素分子，其表达产量为2.1mg/L，为进一步研究该候选杀虫肽分子的生理活性奠定了基础.

原核表达；少棘蜈蚣；κ－SLPTX－Ssm2b；大肠杆菌BL21（DE3）；杀虫肽

化学杀虫剂自发现以来，在预防和治理农业林业害虫以及传播病毒的昆虫方面一直处于霸主的地位.随着时间的发展，一些化学杀虫剂的毒副作用也逐渐暴露出来，这对生态环境产生了极大的影响.例如DDT，其稳定的化学结构，在生态环境中有残留难以降解，且能够在动物体内富集［1］.研究表明，鸟类体内含有DDT会导致其壳蛋变软无法孵育，在南极洲企鹅体内已经检测出DDT的残留，这无疑对生态环境造成了严重的威胁［2－5］.由于老旧化学杀虫剂对害虫和生态系统均有毒害作用，开发一种具有专一作用于害虫，但对其他生物以及环境危害小的新型杀虫剂就显得尤为重要.

蜈蚣是典型的肉食性节肢动物，它的主要捕食对象有蝗虫、蟑螂、蝇类、蛾类等［6］.在捕食过程中，蜈蚣通过颚爪钳将毒液注入被捕食者体内，使其身体抽搐麻痹而失去反抗能力［6－8］.研究表明，蜈蚣的粗毒中主要成分是蛋白质、多肽以及小分子物质等［9］.选择专一性以及易降解的特性，使得蜈蚣毒素成为开发新型杀虫药物的又一选择.

κ－SLPTX－Ssm2a是一种已经从少棘蜈蚣（Scolopendra subspinipesmutilans）毒液中分离纯化出的一种多肽毒素，实验证明极少量的该多肽毒素对苍蝇、粉虱、蟑螂就有明显有效的杀虫活性［10］.由于κ－SLPTX－Ssm2a除了有杀虫活性外，对哺乳动物的钾离子电流也有较强的抑制作用，200 nM的该多肽毒素就能使小鼠DRG细胞的钾离子电流抑制40%［10］.因此筛选一种比κ－SLPTX－Ssm2a副作用低、专一性更强的杀虫肽显得尤为必要.κ－SLPTX－Ssm2b与κ－SLPTXSsm2a的序列具有高度同源性，其活性还没有被鉴定.因此选择κ－SLPTX－Ssm2b作为研究对象.

κ－SLPTX－Ssm2b中含有三对二硫键，在胞质表达过程中容易形成包涵体沉淀，表达后还需进行复性处理［11］，但是将毒素多肽融合SUMO标签表达能够增加表达的可溶性效果并倾向于正确折叠，无需再对毒素多肽复性［12－14］.本文通过将κ－SLPTX－Ssm2b与SUMO标签融合，利用大肠杆菌进行异源表达融合蛋白，通过一系列分离纯化得到纯度较高的样品，为后续进行其杀虫活性研究奠定了基础.

1 材料与方法

1.1 实验材料与试剂

pET－HIS－SUMO表达质粒、大肠杆菌DH 5α菌种、大肠杆菌BL21（DE3）菌种和Ulp1激酶均由本实验室保存和制备.KOD－FX PCR酶体系购于东洋纺（上海）有限公司.BDSHYPERSIL C18柱、蛋白质分子量标准和Dpn I酶购于赛默飞世尔科技公司.DNA纯化回收试剂盒与质粒小提试剂盒购于天根生化科技（北京）有限公司提供.其余试剂均购于生工生物工程（上海）股份有限公司.

1.2 重组表达载体pET－HIS－SUMO－kappa－SLPTX－Ssm2b的构建

从UniProt数据库中获取κ－SLPTX－Ssm2b的氨基酸序列（如图1a）（UniProt蛋白接收号：16S7G9），通过JCat软件（http：//www.jcat.de/）优化的E.coli密码子偏好性的DNA序列（如图1a）由生工生物工程（上海）有限公司合成.根据DNA序列和RF－cloning引物设计原则［15］，设计了上下游引物（5'－3'）：P－κ－SLPTX－Ssm2b－F：G C TCA CCG TG A A CA G A T CG G TGG TGC TA A A A A CCCA TA C TG TA A A G；P－κ－SLPTX－Ssm2b－R：G A TGG TA CCG T CG A CG TCC TG CA G TTA G A A A CA A CA TG G A CCG TA A.通过RF－cloning反应将κ－SLPTXSsm2b的DNA序列无缝插入到pET－HIS－SUMO表达质粒中的sumo标签之后.PCR产物经过1%的琼脂糖凝胶电泳，由凝胶成像仪紫外成像观察后，DNA纯化回收试剂盒进行产物回收.用Dpn I消化酶消化产物中甲基化的DNA模板，将连接产物转化到大肠杆菌DH 5α感受态细胞中，挑选阳性克隆进行菌落PCR筛选并DNA测序.

1.3 κ－SLPTX－Ssm2b的自动诱导表达

将测序正确的重组质粒转化进入BL21（DE3）感受态细菌中.自动诱导表达方法及溶液配方按照Studier F.W.的方法［16］.挑取含有重组质粒的单克隆至2ml含有100μg/ml氨苄青霉素的ZYM－505培养液中，置于37℃摇床中于220 rpm摇菌5 h，然后以1：1 000的转接比至500 ml含有100μg/ml氨苄青霉素的ZYM－5052自动诱导培养液中，置于37℃摇床中220 rpm自动诱导表达16 h.

1.4 κ－SLPTX－Ssm2b的镍柱亲和纯化与酶切

诱导完后离心收集菌体，用100 ml PBS缓冲液重悬菌体，超声破碎后离心收集上清.上清过Ni－NTA纯化柱，用含有50 mM咪唑的PBS缓冲液洗涤镍柱5个柱体积，然后用20 ml含有200 mM咪唑的PBS缓冲液洗脱目的蛋白，最后用20 ml含有400 mM咪唑的PBS缓冲液彻底洗涤镍柱.含200 mM咪唑的PBS洗脱液通过超滤脱盐后，用Ulp1激酶于4℃酶切过夜.

1.5 κ－SLPTX－Ssm2b的反相纯化

酶切液通过0.45μm的滤头过滤，然后上样至C18柱（BDSHYPERSIL C18），乙腈浓度梯度在30 min内从5%增加至35%，以1 ml/min的流速洗脱.收集每一个单峰并冻干，然后于－20℃保存.并通过MALDI－TOF质谱仪检测每个收集峰的分子量.

1.6 κ－SLPTX－Ssm2b的质谱鉴定

通过RP－HPLC收集到的每一个分离峰用灭菌水溶解后，与基质α－Cyano－4－hydroxy－cinnamic acid（CCA）以1：1比例混合，通过Voyager－DETMSTR MALDI－TOF质谱仪鉴定其分子量.

2 实验结果

2.1 κ－SLPTX－Ssm2b重组质粒的构建

通过RF－cloning的方法将κ－SLPTX－Ssm2b的DNA序列成功地无缝插入到pET－HIS－SUMO质粒中（如图1b）.在插入的目的基因多克隆位点的上游是SUMO标签的序列，SUMO上游是一段6 X His组氨酸标签序列和连接序列.组氨酸标签上游是翻译起始密码子（ATG），目的基因下游是终止密码子（TAA）.将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳结果可见一条与理论值基本符合的条带（如图1c箭头所示），证明该基因可能插入到表达载体中.对PCR产物回收并用DpnI酶消化甲基化模板后，转化进大肠杆菌DH5α感受态细菌中，通过菌落PCR筛选出阳性克隆.对阳性克隆提取质粒并进行DNA测序，得到的重组DNA序列与理论相吻合，证明重组表达质粒构建成功.

2.2 κ－SLPTX－Ssm2b的自动诱导表达和镍柱纯化

分别收集ZYM－505培养液，ZYM－5052培养液，破碎菌体后离心的上清、沉淀，含200 mM咪唑的PBS洗脱液，含400 mM咪唑的PBS洗脱液，Ulp1激酶酶切液进行SDS－PAGE电泳分析（见图2）.电泳显示，诱导菌液（图2，泳道3）比未诱导菌液（图2，泳道2）多出一条带，证明融合蛋白经自动诱导表达成功.在菌体破碎离心后的上清中（图2，泳道4）相同位置也有条带，而在沉淀（图2，泳道5）中基本无该条带的存在，证明可溶性表达.先用含有200 mM咪唑的PBS（图2，泳道6）洗脱，后又用含有400 mM咪唑的PBS（图2.泳道7）彻底洗脱发现，含200 mM咪唑的PBS洗脱液中融合蛋白含量最高.将含200 mM咪唑的PBS洗脱液经超滤脱盐浓缩并用Ulp1激酶酶切后（图2，泳道8），出现两条条带，其中一条在3 kD附近（图2，箭头所示），与κ－SLPTX－Ssm2b的分子量3 391 Da相符，说明酶切成功.

图1 重组表达载体pET－HIS－SUMO－kappa－SLPTX－Ssm2b的构建

图2 κ－SLPTX－Ssm2b表达及纯化SDS－PAGE图

2.3 κ－SLPTX－Ssm2b的表达酶切液的RP－HPLC纯化与质谱鉴定分析

将酶切后的样品进行RP－HPLC，进一步进行分离纯化并获得目的毒素分子.将23%～35%浓度的乙腈洗脱的单峰（图3a）分别收集冻干，用MALDI－TOF质谱仪检测其相应的分子量.在33%浓度的乙腈洗脱峰（图3a中箭头所示）经质谱检测分子量为3 390.46 Da（图3b），与理论分子量3 391.04 Da一致.这说明κ－SLPTX－Ssm2b经大肠杆菌BL21（DE3）正确表达并纯化得到纯度较高的样品.

图3 κ－SLPTX－Ssm2b表达酶切液的RP－HPLC纯化与质谱鉴定分析

3 讨论

随着化学杀虫剂的广泛使用，其副作用逐渐凸显，对牲畜、人类及生态环境造成了严重的损害.多肽毒素具有选择性高，易于降解等优势，从产毒动物中挖掘杀虫肽成为下一代杀虫剂的发展趋势.蜈蚣擅长捕食小昆虫，因此蜈蚣体内更可能存在大量作用于昆虫的毒素.蜈蚣全身可入药，因此其体内毒素对人等高等生物的毒副作用可能相对较低.因此，从蜈蚣毒腺中分离具有杀虫药效显著，且对人、牲畜以及生态环境危害小的杀虫肽的可能性更大.通过数据库比对，我们找到了与κ－SLPTX－Ssm2a同源性较高的κ－SLPTX－Ssm2b毒素分子，由于其在毒腺中的丰度极低，因此只在转录组中鉴定了其存在.我们选择了使用原核表达并采取与SUMO融合表达来获得可溶性且正确折叠的κ－SLPTX－Ssm2b（如图2，泳道4）.Ulp1激酶可以识别SUMO标签的空间结构，使得其切割方式更加精准且不产生或错误切割多余的氨基酸序列.因此，通过镍柱纯化并使用Ulp1激酶酶切后，可以获得初步纯化的κ－SLPTX－Ssm2b毒素分子.经过分辨率更高的RP－HPLC系统，获得了单一分子的κ－SLPTX－Ssm2b，并通过质谱鉴定确定其形成了三对二硫键.MALDI－TOF质谱结果显示多步纯化获得的κ－SLPTX－Ssm2b分子的纯度已经达到后续生理活性试验的要求.本文的研究为后续的κ－SLPTX－Ssm2b的生理活性检测试验起了重要的作用，为将来更多的富含二硫键的蜈蚣毒素的原核表达奠定了基础.

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Prokaryotic Expression and Purification ofκ－SLPTX－Ssm2b，a Candidate of Insecticide from Centipede Scolopendra Subspinipes Mutilans

ZHAO Dan，LIU Chang-jun，WU Lei*
（Research Center of Biological Information，National University of Defense Technology，Changsha，Hunan 410073）

Searching NCBIdatabase，κ－SLPTX－Ssm2b was found possessing the similar structure of the toxinκ－SLPTX－Ssm2a，isolated from the centipede Scolopendra subspinipesmutilans，and was speculated asa potential insecticide.The coding sequence was obtained by gene synthesis after codon optimization and was inserted to an expression vector pET－HIS－SUMO，which was then expressed with auto－inductionmethod in the cytoplasm of E.coli strain BL21（DE3）.The fusion protein was purified using Ni－NTA column and digested by Ulp1 protease to release the toxin.The released fragmentwas further analyzed by mass spectrum assay.Itwas demonstrated that themolecular weight of purified fragment（3390.4658 Da）was identical！to its theoretical value（3391.04 Da）.The yield of expression is 2.1 mg/L，which lays the foundation for finding a new insecticidal peptide.

prokaryotic expression；scolopendra subspinipes mutilans；κ－SLPTX－Ssm2b；E.coli BL21（DE3）；insecticide

Q786

A

1671－9743（2015）11－0064－05

2015－09－17

国防科学技术大学校预研“离子通道抑制因子的作用机制”（JC13－02－16）.

赵丹，1991年生，女，河南尉氏人，硕士研究生，研究方向：生物多肽毒素.

*通讯作者：吴磊，1981年生，湖南长沙人，副教授，博士，研究方向：计算生物学.