3种显色反应对稻米籽粒中原花色素含量的检测分析

2015-12-08 05:26刘丽莉白宁宁严明理
湖南工业大学学报 2015年5期
关键词:香草醛花色素染色法

刘丽莉,白宁宁,谢 婧,严明理

(1. 湖南科技大学 生命科学学院,湖南 湘潭 411201;2. 湖南科技大学 重金属污染土壤生态修复与安全利用湖南省高校重点实验室,湖南 湘潭 411201)

3种显色反应对稻米籽粒中原花色素含量的检测分析

刘丽莉1,2,白宁宁1,谢 婧1,严明理1,2

(1. 湖南科技大学 生命科学学院,湖南 湘潭 411201;2. 湖南科技大学 重金属污染土壤生态修复与安全利用湖南省高校重点实验室,湖南 湘潭 411201)

利用二甲基乙酰胺二甲基缩醛(DMACA)染色法、铁铵矾染色法和香草醛染色法,测定了不同品种稻米籽粒中原花色素的含量。用DMACA染色法测得谭农s/制21、R288、凡-14、12庚351、秦稻2号籽粒中原花色素的质量分数依次为0.136, 0.183, 0.085, 4.115, 24.736 mg/g;用铁铵矾染色法测得的质量分数依次为0.292, 0.094, 1.940×10-4, 1.220, 8.080 mg/g;用香草醛染色法测得的质量分数依次为1.349, 1.363, 1.093, 3.733, 15.153 mg/g。检测结果表明:5种稻米品种中,秦稻2号的原花色素含量最高,是12庚351的4.1~6.6倍,凡-14中的含量最低;黑米品种(秦稻2号和12庚351)比白米品种(R288、谭农s/制21和凡-14)中原花色素的含量明显要高。吸光度相对标准偏差(RSD)值表明,3种染色法测定原花色素含量的精密度由高到低依次为:香草醛染色法、DMACA染色法、铁铵矾染色法。

稻米;原花色素;显色反应;DMACA染色法;铁铵矾染色法;香草醛染色法

0 引言

原花色素(proanthocyanidins,PCs)是一类广泛存在于各种植物中的具有特殊分子结构的生物类黄酮,由不同数量的儿茶素(catechin)或表儿茶素(epicatechin)结合而成[1]。最简单的原花色素是儿茶素和表儿茶素单体两者形成的二聚体,此外还有三聚体、四聚体等至十聚体。这类物质共同的特点是在酸性介质中加热均可产生花色素,故被称为原花色素[2]。原花色素是迄今发现的植物源最高效的抗氧化剂之一,能有效清除活性氧自由基,并抑制脂质过氧化。研究表明,原花色素的抗氧化能力是维生素E的5倍,维生素C的2倍,并在机体内迅速吸收完全[3-4]。原花色素在许多植物花和果实的色素形成过程中发挥重要作用[5-7]。目前对于植物原花色素的测定方法较多,如可见分光光度法、高效液相色谱法、液-质谱联用法、化学发光法等[8-9]。植物组织前处理的方法对于样本测定分析十分重要,原花色素是天然的植物多酚类化合物,因成分复杂,不同植物组织其前处理方法也存在差异。正丁醇-盐酸法[10]对测定的选择性较高,多受多酚结构的影响;铁盐催化染色法[11]对测定原花色素的显色反应特征明显,操作简便,但重现性较差;香草醛法[12]对多酚缩合单宁的选择性不太理想,可是对葡萄籽、梗中原花色素的显色反应灵敏度高,效果较稳定[13]。

目前,国内外有关原花色素的研究对象大多集中于葡萄籽、海岸松、山楂、小麦和油菜籽中,而稻米中原花色素的检测研究则较少报道。本文利用二甲基乙酰胺二甲基缩醛(DMACA)染色法、铁铵矾(H4FeNO8S·12H2O)染色法、香草醛染色法3种显色反应研究不同颜色的稻米籽粒中原花色素测定的前处理方法,使稻米中原花色素与染色剂反应显色,通过紫外-可见分光光度法测定其原花色素的吸光值,并比较分析以白、黑米为代表的稻米籽粒中原花色素的相对含量,以期为高原花色素含量的水稻品种选育和稻种资源开发提供参考。

1 试验部分

1.1 试验样品、试剂和仪器

1)试验样品:谭农s/制21、R288、凡-14、12庚351和秦稻2号5个水稻品种,均为去壳的稻米籽粒,研磨成粉末,干燥通风保存。

2)试验试剂:原花色素标准品,南京替斯艾么中药研究所;二甲基乙酰胺二甲基缩醛、香草醛,德国Sigma公司;铁铵矾(H4FeNO8S·12H2O),长沙市迈科为生物科技有限公司;正丁醇(BuOH)、盐酸,均为分析纯,湖南汇虹试剂有限公司;无水乙醇,分析纯,国药集团化学试剂有限公司; 甲醇,分析纯,天津市科密欧化学试剂有限公司。

3)试验仪器:UV756CRT紫外-可见分光光度计,上海佑科仪器仪表有限公司;AUY220型电子分析天平,日本岛津公司;5417R型台式高速冷冻离心机,德国Eppendorf公司;DHG-9070A型电热恒温鼓风干燥箱,上海精宏实验设备有限公司;SC-15C型数控超级恒温槽,宁波天恒仪器厂;BCD-254型冷藏冷冻冰箱,博西华兼用电器有限公司;制冰机,瑞安市康德嘉利机械设备制造厂;DSC-W310型数码相机,索尼有限公司。

1.2 显色剂配制

1) DMACA染色试剂:25 mL 浓度为12 mol/L的HCl与25 mL蒸馏水混溶后,加入0.1 g DMACA溶解,再加入50 mL 95%的乙醇完全溶解,置于4 ℃保存。

2)铁铵矾染色试剂:2.5 mL 浓度为12 mol/L的HCl与12.5 mL蒸馏水混溶后,加入0.3 g铁铵矾溶解,置于4 ℃保存;

3)正丁醇-盐酸试剂:95 mL正丁醇与5 mL 浓度为12 mol/L的 HCl混合即可,4℃保存。

4)香草醛染色试剂:50 mL无水乙醇与50 mL 浓度为12 mol/L的HCl混合后,加入0.3 g香草醛完全溶解后,置棕色试剂瓶中于4 ℃避光保存。

1.3 标准曲线制作和测定方法

1)DMACA显色法:称取0.1 g稻米粉末样品,置于试管中,并加入1.0 mL DMACA染色试剂,30 ℃下水浴2 h,再移至1.5 mL离心管中,在4 500 r/min 、4℃下离心1 min后,取上清液,以染色液作空白对照,测定其在max处的吸光度。

2)铁铵矾显色法:称取0.1 g样品,置于试管中并加入3.0 mL 正丁醇-盐酸试剂,再加入0.10 mL铁铵矾染色剂,沸水浴处理15 min后(水浴8 min时适当混匀反应液),冰水浴15 min,冷却至室温后移至1.5 mL离心管中;然后在4 500 r/min、4 ℃下离心1 min,取上清液,以染色液作空白对照,测定其在max处的吸光度。

3)香草醛显色法:称取0.1 g样品,置于试管中,加入3.0 mL香草醛试剂混匀,30 ℃恒温水浴下显色2 h;然后移至1.5 mL离心管中,在4 500 r/min、4 ℃下离心1 min,取上清液,用香草醛染色剂稀释2.5倍后,以染色液作空白对照,测定其在max处的吸光度。

1.4 精密度试验

取标准储备液,按1.3中试验方法操作,重复5次,利用SPSS 7.0软件对各数据进行统计整理,并以相对标准偏差(RSD)对测定原花色素含量的3种显色方法的精密度进行分析。

2 结果与讨论

2.1 显色反应

2.1.1 原花色素标准样品的显色反应

图1是6种不同质量浓度的原花色素标准样品分别与DMACA染色剂、铁铵矾染色剂、香草醛染色剂起显色反应后的颜色变化对比。由图可以看出:原花色素与DMACA染色反应后,颜色依次呈现深紫蓝至浅紫蓝;原花色素与铁铵矾染色反应后,颜色则依次呈浅红至浅黄色;原花色素与香草醛染色反应后,颜色也依次呈紫红色至浅紫色。

图1 3种方法染色后不同浓度原花色素标准样品的颜色变化Fig. 1 The standard sample color changes of different concentration proanthocyanidins for three staining methods

2.1.2 稻米籽粒中原花色素的显色反应

将5种稻米样品分别与DMACA、铁铵矾、香草醛染色反应后,观察其提取液颜色的变化,并与空白染色液的颜色对比,结果如图2所示。由图可以看出:经DMACA染色反应后,谭农s/制21、R288、凡-14的提取液呈浅蓝色,而12庚351和秦稻2号的提取液则呈深紫色;经铁铵矾染色反应后,谭农s/制21、R288、凡-14的提取液为微黄色,而12庚351和秦稻2号的提取液为深浅程度不一的酒红色;经香草醛染色反应后,谭农s/制21、R288、凡-14的提取液略显浅紫黑色,而12庚351和秦稻2号的提取液为酒红色。

图2 稻米籽粒中原花色素的显色反应结果Fig. 2 Color reaction result of proanthocyanidins in rice grains

2.2 原花色素含量的测定结果

2.2.1 标准样的全波长扫描结果

利用紫外-可见分光光度计在检测波长为300~800 nm范围内,对质量浓度为0.4 mg/mL原花色素标样进行全波长扫描,发现原花色素标样经DMACA、铁铵矾、香草醛染色剂处理后的最大光吸收峰均分布在550 nm处左右,如图3所示。故将试验中稻米籽粒反应液中原花色素含量检测的波长确定为550 nm。

图3 原花色素标准样全波长扫描图Fig. 3 Full spectrum scanning diagram for standard samples of proanthocyanidins

2.2.2 原花色素含量测定的标准曲线

将标准液经DMACA法、铁铵矾法和香草醛法染色反应后,得到原花色素的标准曲线,如图4所示。利用最小二乘法,将原花色素的含量与吸光度进行线性回归分析,得到3种方法的回归曲线方程分别为:

由此可知,这3种染色法测定的原花色素含量与吸光度变化之间均呈良好的线性关系,故均可作为样品中原花色素含量的测定方法。

图4 3种染色法测定原花色素的标准曲线Fig. 4 The standard curves of determining proanthocyanidins by three staining methods

2.2.3 稻米籽粒中原花色素含量的测定

1)DMACA染色法。试验时,谭农s/制2 1、R288、凡-14和12庚351稻米籽粒的提取液均稀释至原来的5倍。因秦稻2号提取液与DMACA染色剂所起的显色反应呈深紫色,不能进入紫外-可见分光光度计的比色测试区间,故将其提取液稀释至原来的20倍,与染色剂反应后再进行检测。通过测定各样本液与DMACA染色剂发生反应的3个时间点(15, 30, 45 s)的吸光度。经计算得5种稻米籽粒中原花色素含量,具体结果见表1。由表可知,原花色素含量最高的是秦稻2号,12庚351次之,最低的是凡-14。

表1 DMACA染色法对稻米样品中原花色素含量的测定结果Table 1 The determining results of proanthocyanidins in rice samples by the DMACA staining

2)铁铵矾染色法。用铁铵矾染色法测定稻米样品反应液时,由于12庚351、秦稻2号籽粒提取液颜色较深不能进入仪器的比色检测区间,故先将其分别稀释至原来的5倍和10倍后再进行试验。铁铵矾染色剂与5 种稻米籽粒提取液在3个反应时间点的吸光度,以及经计算得到的原花色素含量结果如表2所示。由表可知,原花色素含量最高的是秦稻2号,其次是12庚351,凡-14最低。

表2 铁铵矾染色法对稻米样品中原花色素含量的测定结果Table 2 The determining results of proanthocyanidins in rice samples by the Ferric ammonium alum staining

3)香草醛染色法。用香草醛染色法测定各样本反应液中原花色素含量时,先将5 种稻米籽粒提取液均稀释至原来的2.5倍再进行试验,试验和计结果如表3所示。由表可知,原花色素含量最高的是秦稻2号,其次是12庚351,凡-14最低。

由表1~3中3种显色反应的结果表明:5种稻米品种中,秦稻2号原花色素的含量最高,是12庚351的4.1~6.6倍,凡-14中原花色素的含量最低;黑米品种(秦稻2号和12庚351)比白米品种(R288高、谭农s/制21和凡-14)原花色素的含量明显要高。

表3 香草醛染色法对稻米样品中原花色素含量的测定结果Table 3 The determining results of proanthocyanidins in rice samples by the Vanillin staining

2.3 精密度试验分析

按照1.3和1.4节中的方法,对质量浓度为0.24 mg/ mL的原花色素标准液,5次重复测定其吸光度,且以相对标准偏差(RSD)值对试验结果的精密度进行分析,结果如表4所示。由表可知,DMACA染色法的RSD值为3.279%,铁铵矾染色法的RSD值为6.143%,香草醛染色法的RSD值为1.959%。铁铵矾染色法的RSD值大于5%;香草醛染色法和DMACA染色法的RSD值均小于5%,且香草醛染色法具有较低的相对标准偏差。由此表明,香草醛染色法用于测定原花色素含量的精密度最高,DMACA染色法次之,铁铵矾染色法的精密度较差。

表4 精密度试验结果分析Table 4 The precision test result analysis

3 结论

1)由RSD值所反映的3种测定原花色素含量方法的精密由高到低依次是:香草醛染色法、DMACA染色法、铁铵矾染色法,故推荐采用香草醛染色法测定原花色素的含量。采用香草醛染色法检测得谭农s/制21、R288、凡-14、12庚351和秦稻2号稻米籽粒中,原花色素的质量分数分别为1.349, 1.363, 1.093, 3.733, 15.153 mg/g;5种稻米籽粒中原花色素的含量比为1.234∶1.247∶1∶3.415∶13.864。

2)用3种显色方法测得5种稻米籽粒中原花色素的含量结果表明:黑米品种(秦稻2号和12庚351)普遍高于白米品种(R288高、谭农s/制21和凡-14),且黑米品种秦稻2号的原花色素含量是12庚351的4.1~6.6倍。

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(责任编辑:邓光辉)

Determination and Analysis of the Proanthocyanidins Content in Rice Grain Based on Three Color Reaction

Liu Lili1,2,Bai Ningning1,Xie Jing1,Yan Mingli1,2
(1. School of Life Science,Hunan University of Science and Technology,Xiangtan Hunan 411201,China;2. Key Laboratory of Ecological Remediation and Safe Utilization of Heavy Metal-Polluted Soils of Hunan Province Unversifies,Hunan University of Science and Technology,Xiangtan Hunan 411201,China)

The proanthocyanidins content was determined in rice grain of different colors using dimethylaminocinnamaldehyde (DMACA) staining, Ferric ammonium alum staining and Vanillin staining. Experimental studies showed that the proanthocyanidins mass fraction of five rice breeds (Tannong s/zhi21, R288, Fan-14, 12Geng351 and Qingdao2) detected by DMACA staining was successively as follows, 0.136, 0.183, 0.085, 4.115 and 24.736 mg/g (dry weight); the result detected by Ferric ammonium alum staining was 0.292, 0.094, 1.940×10-4, 1.220 and 8.080 mg/g; and the result detected by Vanillin-HCl staining was 1.349, 1.363, 1.093, 3.733 and 15.153 mg/g. The proanthocyanidins content of Qingdao2 was the highest, which was about 4.1 to 6.6 times of 12Geng351, and Fan-14 was the lowest in five rice breeds; the proanthocyanidins content of black rice breeds (Qingdao2 and 12Geng351) was higher than that of white rice breeds (Tannong s/zhi21, R288, Fan-14). The relative standard deviation (RSD) of the absorbency showed that the precision level of determining proanthocyanidins content as follow, the first was vanillin staining, the second was DMACA staining and the third was ferric ammonium alum staining.

rice;proanthocyanidins;color reaction;DMACA staining;ferric ammonium alum staining;vanillin staining

Q819

A

1673-9833(2015)05-0096-06

10.3969/j.issn.1673-9833.2015.05.020

2015-08-21

湖南省普通高等学校教学改革基金资助项目(湘教通[2012]401号),湖南省教育厅科学研究基金资助项目(12C0129)

刘丽莉(1980-),女,湖南邵东人,湖南科技大学讲师,博士,主要从事生物学的教学和研究工作,E-mail:liulili276@126.com

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