顶空-气相色谱-质谱联用法测定血中一氧化碳

张　婷王瑞花于忠山

（1　中国刑警学院　辽宁　沈阳　110035；2　公安部物证鉴定中心　北京　100038）

顶空-气相色谱-质谱联用法测定血中一氧化碳

张婷1王瑞花2于忠山2

（1中国刑警学院辽宁沈阳110035；2公安部物证鉴定中心北京100038）

详细考察了顶空-气相色谱-质谱联用（HS-GC-MS）分析方法测定血中一氧化碳的多种影响因素，包括顶空体积、加热温度、加热时间、加酸方式、制备饱和血样的方法等内容。同时对相同案件检材的HS-GC-MS分析方法与常规分光光度法进行比较，得出HS-GC-MS检测一氧化碳的注意事项，以及其对腐败检材测定更具优势的结论。

一氧化碳顶空-气相色谱-质谱联用法医毒物分析

一氧化碳（CO）与血红蛋白高度的亲和力使血液失去携氧功能，极易造成组织缺氧而引起人的急性中毒或死亡，这类案件时有发生。因此，快速、准确检测血中碳氧血红蛋白含量是判定一氧化碳中毒程度的关键。血中一氧化碳检测常用的方法有分光光度法和紫外导数分光光度法，方法具有操作简便的特点，但分光光度法在计算过程中需应用不同的经验公式来计算含量，因此，分光光度法对于血液的新鲜程度依赖程度较高。HS-GC-MS是色谱分析法，已报道的文献中证明了该法具有灵敏度高、线性范围宽、适合腐败血液、多种生物脏器组织检材等优点。[1-4]但HS-GC-MS法若想在实践工作中作为标准方法来使用，还需要对影响HS-GC-MS定量分析的影响因素进一步考察，还需要对同样检材的常规分光光度法测定与HS-GC-MS测定的结果进行比较。因此，本文就上述内容进行研究，以期对血中一氧化碳的HS-GC-MS分析方法的标准化操作提供借鉴。

1　材料和方法

1.1溶液配制

乳酸溶液：取乳酸12.5mL于带盖锥形瓶中，加去离子水37.5mL，混匀，即得25%乳酸溶液；血液稀释剂：称取0.25g连二亚硫酸钠和0.093g三羟甲基氨基甲烷（THAM），加入100mL去离子水中，混匀。

1.2仪器条件

1.3实验方法

1.3.1饱和血样制备

取血样，用去离子水1∶1稀释后，取适量体积于顶空瓶中，加1-辛醇2～3滴，通入一氧化碳气体30min，每隔2～3min，晃动顶空瓶使一氧化碳制备均匀。30min后取顶空瓶在氮气流下通气2～3min，以便去除血液中未结合血红蛋白的CO气体，密闭保存。

1.3.2检材样品制备

取检血0.4mL(n=2或3)，加入12mL顶空瓶中，铝盖密封，再用1mL注射器抽取25%乳酸液0.5mL注入顶空瓶中，将密封的顶空瓶放入80℃加热块加热10min后，准确抽取0.3mL顶空气体，迅速进行GC/MS分析。

1.3.3对照样品制备

取检血0.4mL(n=2或3)，加入12mL顶空瓶中，按照“1.3.1饱和血样制备”方法，通入一氧化碳气体至检血饱和，用铝盖密封后，余下步骤按照1.3.2等操作过程，准确抽取0.3mL顶空气体，迅速进行GC/MS分析。

2　结果与讨论

2.1定量线性范围

取HbCO饱和血与空白血按比例混合，配制成0%(空白血)、25%、50%、75%、100%浓度的HbCO血各1mL，余下步骤按照1.3.2操作，顶空制样GC/MS分析。以浓度为横坐标x，以吸收峰面积为纵坐标y，得y=1.0×107x+512270（r=0.9924，n=3）。

2.2实验条件考察

2.2.1饱和血样的制备

通气时间：取5份不同来源的空白血液分成5组，每1组空白血再分成4个水平，每个水平通CO气体时间不同，分别为5min、10min、15min、30min和40min，通气体操作同1.3.1。将通好CO的血检材，平行操作分装到12mL顶空瓶中，余下操作同1.3.2。实验结果表明，随着通气时间延长，CO峰面积测值呈上升趋势，5～15min通气时间明显不足，30～40min通气时间测量结果变化不大，证明达到饱和血样制备的要求。这与文献[2]中报道的通CO气体10～20min即可达到饱和的结果不相符，主要原因分析可能是本文采用石英毛细管通CO，CO气泡控制较小，造成反应时间较长。

饱和程度的判定：一氧化碳饱和血样的制备是顶空-气质定量测定的关键性步骤，通常将检材血通CO一段时间，以其作为参比，测定值当作饱和值，如果通气过程达不到饱和程度，会造成测定结果偏高，准确性遭到质疑，用检材饱和血来制作参比，可以消除血色素和腐败的影响，但是以HS-GC-MS法测定来判定碳氧血红蛋白饱和程度，操作方法耗时，对血液的需求量也较大，因此本文借用了紫外分光光度法，快速评价饱和血的测定方法。

这种方法将通CO的血液每隔5min取出1～2滴，用血液稀释剂以1∶200的倍数稀释，在500～600nm范围内扫描，测定538nm和555nm处的吸收光值，按照文献[5]中的经验公式，新鲜血液的（A538/A555）100=1.23左右即认定饱和，或者是在500～600nm范围内扫描的峰型图形不发生改变且（A538/A555）100比值保持不变，也可以认定血液达到饱和程度。

2.2.2顶空热块加热时间

加热时间：顶空瓶采取热块加热的方式，首先将热块温度设定为80℃，接下来取4组顶空瓶，每组3瓶，依次在每个顶空瓶中加入0.4mLHbCO饱和血，密封顶空瓶，加热前用注射器注入25%乳酸0.5mL混匀，置热块加热时间分别为5min，10min，15min和30min，进样比较。结果表明在该温度下加热时间10min足够，时间延长色谱峰吸收峰面积略有下降，但不显著。

加热温度：本实验室已发文献[1、3]报道的方法中考察了热块温度控制在50℃、60℃、70℃、80℃、90℃、100℃、110℃(n=3)等情况下的实验，结果表明加热温度从50～110℃，对其灵敏度几乎不影响，为便于操作，本文选定80℃。

2.2.3加酸及加酸方式考察

酸的种类：在GC/MS定性定量分析中，是检测检材全血中的总CO量，需要加入一定量的酸使结合态HbCO变成游离态CO。本文比较了相同浓度的乳酸和磷酸，分2组，每组3瓶，按照1.3.2的操作方法，比较制备的饱和一氧化碳血液的HS-GC-MS法测定CO峰面积，结果未见明显差异。乳酸属于有机酸，其作用相对温和，在热块加热过程中缓慢释放CO，不建议用强酸反应，强酸会造成血液中蛋白质变性、碳化等现象。

加酸方式：取3组顶空瓶，每组3瓶，依次在每个顶空瓶中加入0.4mL一氧化碳饱和血，第一组直接密封顶空瓶，在热块加热前用注射器加入25%乳酸0.5mL；第二组加入25%乳酸0.5mL后密封顶空瓶，之后热块加热；第三组是加入0.5mL乳酸于小玻璃瓶中，将小玻璃瓶放入顶空瓶后密封，临用前混合。结果表明将乳酸置于小瓶中临用前混合的效果最好，CO损失小，但操作稍微繁琐。加酸后再密封顶空瓶的操作，其过程中会有CO气体损失，在与密封后加酸的操作相比，CO的损失量约为11%。

酸的用量：顶空法分析中两相间的体积变化对测定结果是有影响的，依据计算公式：

式中，A是待测物的气相色谱峰面积；CG是顶空中的待测物的浓度；C0是液体样品中待测物的初始浓度，K是分配系数；β是相量比。参数K的效率由提取温度和β决定，是受两相间（物质）相对的体积量决定。对于一氧化碳这样的一个分配系数比较大的分析物，相比β对峰面积影响不大。本文考察了乳酸加入体积分别为0.5mL和1.0mL，以及检材体积为0.4mL和0.8mL，相对于12mL顶空瓶的总体积来说，β变化不大，体积的少量改变对测定结果未见影响。

2.2.4有关腐败检材的测定

近些年，关于腐败检材CO中毒的检验经常有，也有关于尸体中CO的分布及代谢的研究报道。[6]文献中建立的家兔CO中毒致死模型中，取中毒的新鲜血和室温、4℃、-20℃下放置45天的腐败血进行间断性的HS-GC-MS测定，尽管室温放置的检材均已发黑变臭，但45天后仍能检测到CO含量最低为8.1%。[1、3]尽管这样的数据不能解释CO的产生是由于吸入还是由于死后微生物的分解所产生，但至少说明腐败的血液和CO含量低于10%的检材血液仍能用HS-GC-MS法进行测定。此外，还要提醒的是较低含量的CO鉴定，在出具检验报告时要慎重，长期吸烟的人、交通警察、部分地区的女性，其体内CO的含量也接近10%。[7]

2.3HS-GC-MS法与分光光度法比较

选择5份一氧化碳中毒检材，HS-GC-MS分析时按照1.3.2和1.3.3的操作，分光光度法分析时按照《中国刑事科学技术大全毒物与毒品检验》[8]中的一氧化碳测定法操作，结果如表所示。

表　不同方法测定中毒检材血液中一氧化碳含量（%）

结果表明，对于一氧化碳中毒含量在50-60%时，几种方法测定结果差别不大，通常这一浓度也是判定一氧化碳中毒死亡原因的浓度，但当检材保存不当、中毒量浓度不高时，几种方法差别较大，另外分光光度法无法对凝固的、腐败的血液，脏器检材进行测定。

综上，一氧化碳中毒血的HS-GC-MS法检测是一种相对稳定的测定方法，其线性范围较宽，更适合于血液、脏器、组织等检材操作，但HS-GC-MS法测定的是血液中的总一氧化碳的含量，不排除组织等检材中微量的、正常水平的一氧化碳的干扰。

[1]郝红霞，于忠山，王炯，等．顶空气质联用法测定腐败血、肝检材中CO[J]．中国法医学杂志，2006，21（6）：340-341.

[2]于忠山．顶空气相色谱法测定生物组织中的一氧化碳[J]．中国法医学杂志，1992，7（3）：155-158.

[3]Hao H,Zhou H,Liu X,etal.An accurate method formicroanalysisofcarbon monoxidein putridpostmortem blood by head-space gaschromatography-mass spectro metry(HS/GC/MS)[J].Forensic Sci Int.,2013,229(1-3): 116-121.

[4]Varlet V,De Croutte EL,Augsburger M,et al. Accuracy profile validation of a new method for carbon monoxide measurement in the humanblood using headspace-gaschromatography-massspectrometry (HS-GC-MS)[J].J Chromatogr B， 2012， 880(1): 125-131.

[5]陈焘．毒理学教材[M]．第2版，北京：人民卫生出版社，2004：78-82.

[6]Vassiliki A.Boumba,Theodore Vougiouklakis. Evaluation of the Methods Used for Carboxyhemoglobin Analysis in Postmortem Blood[J].International Journal of Toxicology，2005，24:275-281.

[7]王海玲，李君，王利民．唐山市交通废气污染对交通警察HBCO饱和度的影响[J]．中国疗养医学，2004，13（2）：79-80.

[8]刘文．中国刑事科学技术大全（毒品和毒物检验）[M]．北京：中国人民公安大学出版社，2003：698-700.

（责任编辑：于萍）

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2095-7939(2015)01-0075-03

2014-10-27

张婷（1975-），女，辽宁沈阳人，中国刑警学院法化学系讲师，硕士，主要从事刑事毒物毒品分析研究。