黄芩不同药用部位水煎液对急性肝损伤小鼠保肝作用的研究

耿广琴， 杨志军， 杨秀娟， 李 晶

（甘肃中医药大学，甘肃兰州730000）

黄芩不同药用部位水煎液对急性肝损伤小鼠保肝作用的研究

耿广琴， 杨志军*， 杨秀娟， 李 晶

（甘肃中医药大学，甘肃兰州730000）

目的 研究黄芩水煎液对CCl4致肝损伤模型小鼠肝细胞DNA及肝超微结构的影响，探讨黄芩茎叶保肝作用的效果。方法 将72只小鼠，随机分为正常对照组、模型组、联苯双酯对照组、7月份黄芩茎叶组、10月份黄芩茎叶组、黄芩根组。正常对照组、模型组每日每只给予0.2 mL/10 g的生理盐水，联苯双酯对照组每日每只给予联苯双酯150 mg/kg，黄芩各组每日每只按相当于生药量6 g/kg剂量给小鼠灌服黄芩水煎液，连续灌胃7 d。末次给药2 h后，除正常对照组外，其余各组均腹腔注射0.1%CCl4橄榄油溶液0.1 mL/10 g建立小鼠急性肝损伤模型，正常对照组腹腔注射等体积橄榄油。18 h后，剖取肝组织，检测肝细胞DNA损伤，观察肝超微结构变化。结果 给予黄芩水煎液后，小鼠肝细胞DNA尾长、尾矩、Olive尾矩均有所减少，其中黄芩根组与模型组相比，差异极显著 （P＜0.01），茎叶组与模型组相比，差异不显著 （P＞0.05）。黄芩根组肝细胞结构基本正常，黄芩茎叶组肝细胞胞质内细胞器肿胀，部分线粒体空泡变性，对肝超微结构的损伤缓解作用不显著。结论 黄芩根水煎液具有一定的保肝作用，与黄芩根相比，黄芩茎叶的作用较弱，黄芩茎叶的药用功效尚需进一步开展实验研究。

黄芩；不同部位；肝损伤模型；DNA损伤；超微结构变化

黄芩Scutellaria baicalensis Georgi是我国常用中药材，使用历史悠久。传统药用其根，茎叶部分通常被废弃。随着对黄芩化学成分、药理作用研究的深入，发现不仅黄芩的根有着广泛的药用功效，其茎叶也是不容忽视的良好药材［1-2］。有研究表明黄芩茎叶与黄芩根相同，也具有较好的抗氧化、抗炎、抗肿瘤、保肝等药理活性［3-6］。为科学评价黄芩茎叶的药用价值，本实验通过研究黄芩水煎液对CCl4致肝损伤模型小鼠肝细胞DNA及肝超微结构的影响，探讨黄芩茎叶保肝作用的效果。

1 材料与方法

1.1 试验药物 黄芩茎叶，分别于7月底、10月底采自甘肃陇西；黄芩根，两年生，11月初采自甘肃陇西，经甘肃中医药大学药学院杜弢教授鉴定为唇形科植物黄芩Scutellaria baicalensis Georgi。取黄芩根、茎叶适量，第1次加10倍量水煎煮1 h，第2次加8倍量水煎煮1 h，合并2次提取液，过滤后，水浴浓缩成含生药量为1 g/mL的水煎剂，分光光度法测得根中黄芩总黄酮的量为10.21%，7月份茎叶中黄芩总黄酮的量为3.01%，10月份茎叶黄芩总黄酮的量为1.58%。高压灭菌，置4℃冰箱备用。

1.2 动物 2月龄昆明种小鼠72只 （SPF级），雌雄各半，体质量 （20±2）g，购自兰州大学实验动物中心。合格证号：SCXK（甘）2009-0004。

1.3 试剂 四氯化碳 （CCl4，分析纯，上海凌峰化学试剂有限公司，批号120728），使用时用橄榄油配制成0.1%的橄榄油溶液；联苯双酯滴丸 （北京协和药厂，批号12090204），使用时用蒸馏水溶解稀释至所需剂量。正常熔点的琼脂糖 （NMA），低熔点的琼脂糖 （LMA），均为美国Sigma公司产品；台盼兰，三羟甲基氨基甲烷 （Tris），二甲基亚砜 （DMSO）、溴化乙锭 （EB）等均为国产分析纯。

1.4 仪器 BS224S型电子天平 （赛多利斯科学仪器有限公司产品）；HH-4数显恒温水浴锅 （郑州杜甫仪器厂产品）；XYJ80-20型离心机 （金坛市恒丰仪器厂产品）；XW-80A型旋涡混匀器 （上海精科实业有限公司产品）；DYY-Ⅲ型电泳仪（北京六一厂产品）；CKX41-F32FL荧光倒置显微镜 （日本奥林巴斯公司出品）；JEOL-1230透射电子显微镜 （日本电子公司生产产品）。

2 方法

2.1 小鼠分组与造模 将72只小鼠，随机分为6组，每组12只，雌雄各半，分别为正常对照组、模型组、联苯双酯对照组、7月份黄芩茎叶组、10月份黄芩茎叶组、黄芩根组（根据前期小鼠组织中SOD活性、MDA水平等指标的检测结果分析，发现黄芩水煎剂高剂量6 g生药/kg保肝作用较理想，本实验中不再设置黄芩低、中剂量治疗组）［7］。适应性喂养3 d，采用灌胃给药。正常对照组、模

型组每日每只给予0.2 mL/10 g的生理盐水，联苯双酯对照组每日每只给予联苯双酯150 mg/kg，黄芩各组每日每只按相当于生药量6 g/kg给小鼠灌服黄芩水煎液，连续灌胃7 d。末次给药2 h后，除正常对照组外，其余各组均腹腔注射0.1%CCl4橄榄油溶液0.1 mL/10 g建立小鼠急性肝损伤模型，正常对照组腹腔注射等体积橄榄油。

禁食不禁水18 h后，各组小鼠称重，断头处死，迅速剖取肝组织，用预冷的4℃生理盐水洗净表面残血备用。

2.2 单细胞凝胶电泳（SCGE）检测DNA损伤 用37℃的PBS缓冲液冲洗肝组织，匀浆，加适量PBS悬浮细胞，收集细胞悬液于1.5 mL的ephendorf管中，静置下沉3 min，将上部悬液转至另一ephendorf管中，800 r/min离心5 min，弃上清，用PBS将细胞浓度调整至104～105个/mL。台盼兰检测细胞活率，大于90%方可进行实验。

单细胞凝胶电泳按照Singh［8］描述的方法稍加改进，25 V，300 mA，电泳30 m in。EB染色，荧光显微镜下观察，拍照。选择尾长（tail length，TL）、尾矩（tail moment， TM）、Olive尾矩（Olive tail moment，OTM）为DNA损伤指标。

2.3 超微结构观察 取大鼠肝组织结构1 mm3，3%戊二醛固定液固定，环氧树脂包埋，甲苯胺蓝染色，光镜下定位，超薄切片后，透射电子显微镜观察肝组织结构。

2.4 统计学处理 采用SPSS 13.0软件对数据进行统计与分析，实验结果以表示，组间差异采用one-way ANOVA分析，P＜0.05表示差异显著，P＜0.01表示差异极显著。

3 结果

3.1 小鼠肝细胞DNA损伤 如表1所示，模型组小鼠肝细胞DNA尾长、尾矩、Olive尾矩较正常对照组均明显增加 （P＜0.01）。给予黄芩水煎液后，小鼠肝细胞DNA尾长、尾矩、Olive尾矩均有所减少，其中黄芩根组与模型组相比，差异极显著 （P＜0.01），茎叶组与模型组相比，差异不显著 （P＞0.05）。

表1 小鼠肝细胞DNA损伤（，n=12）

表1 小鼠肝细胞DNA损伤（，n=12）

注：与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与正常对照组比较，#P＜0.05，##P＜0.01

组别 动物数/只 尾长（TL）/μm 尾矩（TM）/μm Olive尾矩（OTM）/μm正常对照组 12 3.89±0.24** 0.73±0.05** 0.57±0.04**模型组 12 19.11±0.53## 6.93±0.35## 6.11±0.27##联苯双酯对照组 12 5.52±0.38**## 1.00±0.06** 0.62±0.04**7月份黄芩茎叶组 12 17.94±0.35*## 6.71±0.20## 5.43±0.28*##10月份黄芩茎叶组 12 18.77±0.43## 6.78±0.28## 5.97±0.20##黄芩根组 12 6.56±0.26**## 1.20±0.13** 0.71±0.03**

3.2 肝超微结构变化 肝脏超微结构变化见图1。正常对照组肝细胞核呈椭圆形，核膜平整光滑，胞质内细胞器丰富，粗面内质网、线粒体、核糖体等结构正常，肝血窦面及肝血窦腔正常；模型组肝细胞核体积相对于正常略有缩小，核异染色质增多，线粒体、内质网数量明显减少，部分线粒体肿胀。联苯双酯对照组肝细胞结构基本正常，肝细胞之间连接结构正常；7月份黄芩茎叶组肝细胞胞质内细胞器肿胀，部分线粒体空泡变性，肝血窦面异常明显，肝血窦腔高度肿胀；10月份黄芩茎叶组肝细胞核形态异常，核体积缩小，核周异染色质增多，肝血窦腔电子密度降低，部分线粒体空泡变性；黄芩根组肝细胞结构基本正常，但个别线粒体有肿胀现象。

4 讨论

在CCl4诱导小鼠肝损伤中，过氧化反应产生的氧自由基是肝损伤形成的主要机制［9-11］。体内累积过多的氧自由基将攻击膜不饱和脂肪酸、蛋白质、DNA等生物大分子，损伤这些生物大分子，影响他们的功能［12-14］。

DNA是重要的遗传物质，DNA通过转录和翻译将遗传信息传递给蛋白质，蛋白质作为生命活动的执行者，因此，DNA的稳定对于生命体的正常繁殖和生长是至关紧要的。DNA链的断裂可使核酸的完整性和核型受到破坏，导致转录失调，影响蛋白质的合成，最终引起细胞死亡。

图1 各组小鼠肝细胞超微结构 （×10 000）

SCGE结果显示模型组小鼠肝细胞DNA尾长、尾矩、Olive尾矩明显增高，说明CCl4诱导了肝细胞DNA损伤，给予黄芩根水煎剂后，模型小鼠肝细胞DNA损伤减轻，表明黄芩根水煎液对维持肝细胞DNA结构的稳定具有积极的作用。黄芩茎叶水煎液与模型组相比，虽可以降低肝损伤小鼠肝细胞DNA尾长、尾矩、Olive尾矩，减轻肝细胞DNA的损伤强度，但差异并不显著。

肝细胞超微结构观察结果显示，模型组肝细胞超微结构出现了明显异常改变，主要表现为细胞核体积相对缩小，胞质内线粒体肿胀，线粒体、内质网数量明显减少。黄芩

根组明显改善肝细胞超微结构，黄芩茎叶组呈现出细胞核形态异常，细胞器明显肿胀，部分线粒体空泡变性等症状，表明黄芩茎叶水煎液对肝超微结构的损伤缓解作用不显著，与肝细胞DNA损伤的测定结果相一致。

孟艳彬［15］等采用紫外分光光度法对连续3年的黄芩茎叶总黄酮的量进行测定，采用HPLC法对一年内不同月份黄芩茎叶的总黄酮的量进行测定，结果发现黄芩茎叶总黄酮以7、8月份的量较高。本实验参照文献，同时从中药生产实际出发，分别采集7月份、10月份黄芩茎叶，研究其对肝细胞的保护作用。结果表明，7月份黄芩茎叶水煎液对肝细胞的保护作用稍高于10月份黄芩茎叶水煎液，但二者对肝细胞的保护效果均明显弱于黄芩根水煎液。这与分光度法测定根、茎叶中黄芩有效成分总黄酮的量高低相符合，表明黄芩保肝的疗效与其所含的活性物质总黄酮的量密不可分，黄酮含有量的高低直接影响着黄芩药理作用的发挥。

综上所述，黄芩根水煎液具有一定的保肝作用，其作用机理可能是通过减轻肝细胞DNA的损伤，减缓肝细胞超微结构异常变化，而起到保护肝脏的作用，与黄芩根相比，黄芩茎叶的作用较弱，黄芩茎叶的药用功效尚需进一步开展实验研究。

［1］ 张建祥.黄芩茎叶的药理作用研究［J］.湖北中医学院学报，2010，12（4）：63-65.

［2］ 商亚珍，苏丙凡.黄芩根及其茎叶成分的药理学研究进展［J］.承德医学院学报，2005，22（2）：153-155.

［3］ 唐世英，胡桂才，刘俊英.黄芩茎叶总黄酮对低密度脂蛋白氧化的影响［J］.山东医药，2009，49（13）：66-67.

［4］ 王 玮，白 月，王俊平.黄芩茎叶总黄酮对大鼠气囊滑膜炎抗炎作用机制的研究［J］.沈阳医学院学报，2008，10（1）：24-25.

［5］ 杨鹤松.黄芩茎叶总黄酮对LA795小鼠肺腺癌的抑制作用［J］.承德医学院学报，2008，25（4）：439.

［6］ 杨鹤梅，李素婷，梅立新，等.黄芩茎叶总黄酮对纤维化大鼠肝脏星形细胞活化的影响［J］.中国中医基础医学杂志，2006，12（1）：42-44.

［7］ 耿广琴，杨志军，杨秀娟，等.道地黄芩与甘肃产黄芩对急性肝损伤小鼠保肝作用的比较研究［J］.中医药学报，2015，43（3）：42-44.

［8］ Singh N P，McCoy M T，Tice R R，et al.A simple technique for quantitation of low levels of DNA damage in individual cells［J］.Exp Cell Res，1988，175（1）：184-191.

［9］ Bedossa P，Houglum K，Trautwein C，etal.Stimulation of collagen a1（I）gene expression is associated with lipid peroxidation in hepatocellular injury：a link to tissue fibrosis［J］.Hepatology，1994，19（5）：1262.

［10］ 戴志强，俞月桂，袁幸菊，等.氧代赖氨酸抗四氯化碳所致小鼠肝细胞损害的超微结构观察［J］.中国药理学和毒理学杂志，1994，8（2）：139-141.

［11］ Trocha M，Merwid-Lad A，Szuba A，et al.Effectof simvastatin on nitric oxide synthases and arginine and its derivatives in ischemia/reperfusion injury in rat liver［J］.Pharmacol Rep，2010，62（2）：343-345.

［12］ Nyska A，Kohen R.Oxidation of biological systems：oxidative stress phenomena，antioxidants，redox reactions，and methods for their quantification［J］.Toxicol Pathol，2002，30（6）：620-650.

［13］ Draper H H，Csallany A S，HadleyM.Urinary aldehydes as indicators of lipid peroxidation in vivo［J］.Free Radic Biol Med，2000，29（11）：1071-1077.

［14］ Sczepanski J T，Jacobs A C，Majumdar A，et al.Scope and mechanism cross-link formation by the C4′-oxidized abasic site［J］.JAm Chem Soc，2009，131（31）：11132-11139.

［15］ 孟艳彬，赵春颖，高晓燕.不同生长期黄芩茎叶中总黄酮及野黄芩苷的含量测定［J］.承德医学院学报.2003，20（3）：258-259.

R285.5

B

1001-1528（2015）12-2753-03

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.12.039

2014-07-10

2012甘肃省高校基本科研业务费项目 《甘肃黄芩品质的综合考察与评价研究》（BH2012-020）

耿广琴 （1971—），女，动物学硕士，讲师，主要从事生物化学的教学及研究。Tel：13893468930，E-mail：gengguangqin94 @126.com

*通信作者：杨志军，女，副教授。主要从事中药学的教学及研究。Tel：13389310964，E-mail：yangzhijun@yeah.net