广金钱草总黄酮成分不同提取方法的比较

罗 兰， 张素中*， 黄月纯， 卢小燕， 黄燕媚， 邵华宇

（1.中山大学新华学院，广东广州510520；2.广州中医药大学第一附属医院，广东广州510405）

广金钱草总黄酮成分不同提取方法的比较

罗 兰1， 张素中1*， 黄月纯2， 卢小燕1， 黄燕媚1， 邵华宇1

（1.中山大学新华学院，广东广州510520；2.广州中医药大学第一附属医院，广东广州510405）

目的 比较不同方法提取广金钱草中总黄酮成分的效果。方法 以总黄酮提取率及HPLC指纹图谱评价水提法、醇提法、酶解法和半仿生法提取广金钱草的效果，紫外分光光度法测定总黄酮含有量，HPLC指纹图谱共有模式评价各提取液中黄酮类共有成分的变化。结果 酶解法与醇提法的总黄酮得率都较高，其中前者对广金钱草的特征成分夏佛塔苷的提取效果更好，而水提法与半仿生法的提取效果较差，尤以后者为甚。结论 4种提取方法的效果依次为酶解法＞醇提法＞水提法＞半仿生法。

广金钱草；总黄酮；水提法；醇提法；酶解法；半仿生法

广金钱草为豆科植物广金钱草Desmodium styracifolium（Osb.）Merr.的干燥地上部分，具有利湿退黄、利尿通淋的功效，主治黄疸尿赤、热淋、石淋、小便涩痛、水肿尿少［1］，主要分布于广东、广西、云南、四川、福建等地，生于山坡、草地、土坎或灌木丛中，是两广地区大宗栽培的药材。目前，已经有多种提取广金钱草总黄酮成分的方法［2-6］，其中水提法和醇提法最常用［7-11］，但由于存在细胞壁，故提取过程不完全，而酶解法和半仿生法都能破坏细胞壁，提高有效成分的提取率，具有很大的应用价值［12-16］，但至今仍鲜有相关的研究报道［17］。本实验分别采用水提法、醇提法、酶解法和半仿生法来提取广金钱草总黄酮成分，然后通过紫外分光光度法和高效液相色谱法进行检测，从而选出最优的方法，为广金钱草制剂的生产以及相关工艺的研究提供实验基础和参考。

1 材料与仪器

1.1 材料 广金钱草 （清平市场和药店，共10批，批号分 别 为 100311、 100517、 101027、 100621、 100328、100910、100705、100612、100726、101008，产地广西），经中山大学新华学院张素中副教授鉴定为豆科植物广金钱草Desmodium styracifolium（Osb.）Merr.的干燥地上部分。

1.2 试剂 芦丁对照品 （纯度≥98%，中国药品生物制品检定所，批号10080-200707）；纤维素酶 （酶活力20 000 U/g，北京宁馨儿生物科技开发有限公司）。所用试剂均为分析纯。

1.3 仪器 UV-1102型紫外分光光度计 （上海天美科学仪器有限公司）；CJS80型高效粗粉机 （江阴市优协机械制造有限公司）；电热恒温水浴锅 （上海福玛实验设备有限公司）；FA2004N型电子天平 （上海精密科学仪器有限公司）；水浴恒温振荡器 （金坛市宏华仪器厂）；Agilent 1200 HPLC色谱仪，包括四元梯度泵、柱温箱、二级管阵列检测器、紫外检测器、Chemstation工作站（美国安捷伦科技公司）。

2 实验方法与结果

2.1 不同提取方法提取液的制备

2.1.1 水提法提取液的制备 称取干燥广金钱草粗粉 （过20目筛）10 g，加水100 mL，浸泡30 min，煮沸后文火慢煎40 m in，趁热用4层纱布滤过，药渣加水100 mL，煮沸后再慢煎30 min，趁热滤过，合并两次煎液，浓缩到20 m L，50%甲醇溶解并定容至50 mL，即得。

2.1.2 醇提法提取液的制备 称取干燥广金钱草粗粉 （过20目筛）10 g，加65%乙醇100 mL，回流两次，第一次2 h，第二次1.5 h，合并两次提取液，浓缩到20 mL，50%甲醇溶解并定容至50mL，即得。

2.1.3 酶解法提取液的制备 称取干燥广金钱草粗粉 （过20目筛）10 g，加10倍量水混匀，再加入纤维素酶0.06 g，酶解1 h（温度50℃、pH为6），然后用相对于粗粉6倍量的80%乙醇溶液提取1 h，冷却滤过，药渣加5倍量60%乙醇回流30 min，冷却滤过，弃去药渣，合并提取液，浓缩到20mL，50%甲醇溶解并定容至50 mL，即得。

2.1.4 半仿生法提取液的制备 称取干燥广金钱草粗粉（过20目筛）10 g，选择pH为2.2的磷酸氢二钠缓冲液100 mL作为浸取剂，模拟胃肠道pH，40℃下回流提取3次，每次2 h，合并提取液，浓缩到20 mL，50%甲醇溶解并定容至50 mL，即得。

2.2 不同提取工艺的提取率比较分析

2.2.1 对照品溶液的制备 精密称取在120℃下干燥至恒重的芦丁标准品20.60 mg，置于50 mL量瓶中，加入60%乙醇适量，置水浴上微热溶解，放冷后以60%乙醇稀释至刻度，摇匀。再精密吸取25 mL，置于50 mL量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得每1mL含芦丁0.206mg的对照溶液。

2.2.2 测定波长的选择 精密量取对照品溶液3 mL，置于25m L量瓶中，加30%乙醇至6.0 mL，再加5%亚硝酸钠溶液1 mL，摇匀，放置6 m in，加10%硝酸铝溶液1 mL，摇匀，放置6min。然后，加氢氧化钠试液10 mL，再加30%乙醇至刻度，摇匀，放置15 min，按紫外分光光度法进行扫描。结果显示，在508 nm处有最大吸收，故确定检测波长为508 nm。

2.2.3 标准曲线的绘制 精密量取对照品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0 mL，置于25 m L量瓶中，加30%乙醇至6.0 mL，再加5%亚硝酸钠溶液1 mL，摇匀，放置6 m in，再加10%硝酸铝溶液1 mL，摇匀，放置6 min。然后，加氢氧化钠试液10 mL，再加30%乙醇至刻度，摇匀，放置15 min，以相应试剂为空白，在508 nm波长处测定吸光度，以质量浓度 （G）为纵坐标 （y），吸光度 （A）为横坐标 （x），绘制标准曲线，得回归方程y=8.771 9x+ 0.013，r2=0.999 8。

2.2.4 供试品的制备 分别取 “2.1”项下4种提取液适量，过滤，吸取续滤液15 mL，适当浓缩，50%甲醇定容至5mL，即得。

2.2.5 总黄酮提取率的测定 取各供试品适量，过滤，取续滤液4.0 mL，置于10 mL量瓶中，用60%乙醇稀释至刻度。再精密量取稀释液1 mL，置于25 mL量瓶中，加30%乙醇至6.0 mL，再加5%亚硝酸钠溶液1 mL，摇匀，放置6 min，加10%硝酸铝溶液1 mL，摇匀，放置6 min。然后，加氢氧化钠试液10 mL，再加30%乙醇至刻度，摇匀，放置15min，以相应试剂为空白，在508 nm波长处测定吸光度，利用标准曲线计算样品的总黄酮提取率，计算公式为

注：G为标准曲线上的黄酮含有量；D为稀释倍数；V为样液体积；W为广金钱草粗粉质量

2.2.6 实验结果与分析 各批次总黄酮提取率见表1，然后以酶法提取为基准，比较相对提取率，见表2。由表可知，酶解法与醇提法的总黄酮提取率较高，并且其差异不明显，而半仿生与水提法则较低，也无明显差异，并且均只相当于酶解法与醇提法的75%左右。

表1 4种提取方法的总黄酮提取率

表1 4种提取方法的总黄酮提取率

批次 水提法/% 醇提法/% 酶解法/% 半仿生法/% 1 0.346±0.008 0.408±0.008 0.438±0.008 0.357±0.009 2 0.343±0.005 0.466±0.009 0.563±0.009 0.413±0.011 3 0.375±0.007 0.352±0.007 0.470±0.011 0.243±0.011 4 0.345±0.008 0.330±0.007 0.441±0.009 0.224±0.009 5 0.386±0.009 0.398±0.005 0.483±0.004 0.292±0.007 6 0.333±0.010 0.476±0.005 0.447±0.005 0.380±0.009 7 0.457±0.006 0.550±0.009 0.538±0.007 0.443±0.008 8 0.452±0.008 0.584±0.003 0.542±0.002 0.485±0.004 9 0.377±0.005 0.473±0.010 0.475±0.005 0.417±0.003 10 0.382±0.003 0.460±0.008 0.477±0.009 0.364±0.009

表2 4种提取方法的总黄酮相对提取率

3 广金钱草工艺的指纹图谱评价

3.1 色谱条件 Zorbax SB-Aq色谱柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流动相为乙腈 -0.2%磷酸水溶液，梯度洗脱（0～30 min，12%→14%乙腈；30～40 min，14%→16%乙腈；40～55 m in，16%→25%乙腈）；检测波长为270 nm；柱温为40℃；体积流量为1mL/min。

3.2 供试品溶液的制备 同 “2.2.4”项。

3.3 方法学的考察

3.3.1 精密度试验 取供试品溶液10μL，连续进样6次。结果，11个共有峰的RSD值均小于3.0%，表明仪器精密度良好。

3.3.2 稳定性试验 取供试品溶液10μL，分别在0、2.5、5、7.5、10、24 h进样。结果，11个共有峰的RSD值均小于3.0%，表明供试品溶液在24 h内稳定性较好。

3.3.3 重复性试验 取同一批样品6份，按 “3.2”项下方法制备供试品溶液，进样分析。结果，11个共有峰的RSD值均小于3.0%，表明该方法重复性良好。

3.4 指纹图谱的建立与分析

3.4.1 样品检测 精密吸取各提取方法所得的供试品溶液10μL，进样分析，指纹图谱相似度软件生成各提取法的共有模式，见图1。

图1 4种提取方法的共有模式

3.4.2 各提取工艺的指纹图谱分析 各提取样品中均检出11个主要黄酮类指纹峰。为了对其相对提取率进行量化分析，分别对各供试液的实际峰面积按生药质量浓度0.1 g/mL进行折算，再以广金钱草酶提法试液的特征峰面积为100%计，计算各提取工艺样品供试液的峰面积相对转移率，结果见表3。

表3 各提取工艺样品供试液的峰面积相对转移率

表3 各提取工艺样品供试液的峰面积相对转移率

峰号 水提法/% 醇提法/% 酶解法/% 半仿生法/% 1 74.12±11.78 87.24±24.08 100 64.98±20.32 2 63.44±15.86 71.59±17.06 100 57.00±13.08 3 70.37±16.38 80.58±19.46 100 63.04±11.50 4 58.99±9.86 77.41±23.01 100 55.00±14.91 5 70.12±19.13 86.45±22.01 100 57.34±15.04 6 37.86±6.71 80.15±20.69 100 28.54±9.79 7 47.01±10.85 89.47±26.29 100 34.25±9.31 8 40.72±5.75 82.54±19.11 100 42.87±10.12 9 66.33±10.81 79.95±25.56 100 67.14±16.52 10 76.96±8.74 88.18±24.00 100 78.01±18.85 11 40.70±6.22 99.48±14.96 100 48.35±10.35

3.5 同一批样品不同提取方法的指纹图谱 由图2可知，在广金钱草指纹图谱的11个特征峰中，4种提取方法对提取效果都有不同程度的影响。以最强峰夏佛塔苷 （5号）而言，其占总峰面积的比例达25.15%，酶解法效果最好；次强峰 （9号）及其余各峰占总峰面积的比例达18.41%，醇提法效果比较好。可见，酶解法与醇提法的总黄酮提取率相当，但它们对HPLC指纹图谱中各成分提取效果的影响还是有一定差异的，而半仿生法和水提法对11个特征峰的提取效果均不理想，尤以水提法最差。

图2 同一批样品4种提取方法的重叠图

4 讨论

酶解法与醇提法效果的差异不大，两者都用乙醇进行提取，但前者用到了纤维素酶类来破坏广金钱草的细胞壁，从而使提取率普遍提高。而半仿生法使用磷酸氢二钠缓冲液，由于总黄酮成分的溶解性在酸性物质中增大，故该方法的提取率略高于水提法。

根据广金钱草总黄酮的测定结果来进行指纹图谱的测定，发现4种方法的保留时间相当，但峰面积以及相对峰面积有明显差异。总体来说，酶解法和醇提法的峰面积比较大，而且相近，而水提法和半仿生则比较小，两者相差也不大。

综合总黄酮提取率及广金钱草指纹图谱特征峰的提取效果，可知4种提取方法的效果依次为酶解法＞醇提法＞水提法＞半仿生法。

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R284.2

B

1001-1528（2015）11-2537-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.11.047

2014-07-08

广东省科技计划项目 （2009B060700012）

罗 兰（1984—），女，硕士，工程师，从事药物质量分析。Tel：（020）87065055，E-mail：zirolland@126.com

*通信作者：张素中 （1969—），女，硕士，副教授，从事中药质量标准与指纹图谱研究。Tel：（020）87065055，E-mail：Zhangsz620 @163.com