山核桃青皮萃取物抗内源性H2O2致血管内皮细胞凋亡及机制研究

赵行宇， 秦迎新， 沈 楠， 赵丽静， 朱文赫， 陈默然， 张 巍

（吉林医药学院，吉林吉林132013）

山核桃青皮萃取物抗内源性H2O2致血管内皮细胞凋亡及机制研究

赵行宇， 秦迎新， 沈 楠， 赵丽静， 朱文赫， 陈默然， 张 巍

（吉林医药学院，吉林吉林132013）

目的 探讨山核桃青皮萃取物对过氧化氢 （H2O2）诱导血管内皮细胞凋亡的影响及可能机制。方法 以葡萄糖氧化酶 （GOX）催化生成内源性H2O2制作内皮细胞损伤模型；加入不同剂量的山核桃青皮萃取物，观察细胞形态学改变；Annexin/PI双标记染色，流式细胞仪检测细胞凋亡率；Western blot检测Caspase-3及Bcl-2和Bax蛋白表达量。结果 山核桃青皮萃取物改善了内源性H2O2导致的内皮细胞形态变化；流式检测结果显示萃取物对细胞模型凋亡有明显的抑制作用；电泳结果显示Caspase-3和Bax表达量降低，Bcl-2表达增加，随剂量增加，作用增加，具有剂量依赖性。结论 山核桃青皮萃取物对内源性H2O2诱导的血管内皮细胞凋亡有抑制作用，其机制可能通过启动Caspase途径实现。

山核桃；细胞凋亡；过氧化氢

血管内皮损伤是动脉粥样硬化等多种疾病发生的重要因素，在针对血管内皮损伤及保护作用进行的研究中，关于中药提取成分的作用及机制的研究，近年有所增加［1-6］。内皮细胞损伤的原因中，氧化应激受到一些研究者的关注，因为氧化应激不仅可以直接导致细胞损伤，出现凋亡，而且多种凋亡刺激都伴随有氧化应激或者增加了细胞内活性氧集团ROS水平［7-8］。研究也表明，通过抑制氧化应激可以抑制细胞凋亡，许多凋亡抑制剂都是通过增强细胞抗氧化的能力发挥作用，或者其本身就具有抗氧化活性。山核桃青皮是山核桃未成熟果实的青果皮，具有清热解毒、抑菌镇咳及抗癌等作用［7-10］。相关研究表明：山核桃青果皮萃取物在体外具有抗氧化活性［11-13］，但针对内皮氧化应激损伤后，萃取物对其的作用及相关机制未见报道。本研究以GOX催化葡萄糖产生内源性H2O2制作内皮细胞损伤模型，观察山核桃青皮萃取物干预后，氧化应激损伤的血管内皮细胞凋亡变化，并对这一作用的可能机制进行探讨，为后续的研究提供进一步的证据。

1 材料方法

1.1 药物萃取 山核桃采自吉林省林区，室温下晾干。将核桃果实处理后得核桃青皮，用80%乙醇回流萃取30 min，于低温回收溶剂，萃取物用水分散后用乙酸乙酯萃取，回收溶剂得萃取物0.324 kg，采用普鲁士蓝法测定总酚的量，极性部位总酚的量为18.2%。收集于旋转蒸发瓶中蒸干，过滤除菌，萃取物称重以DMSO溶解终质量浓度为500μg/mL［14］。

1.2 试剂 胎牛血清由杭州四季青公司生产；高糖DMEM培养基购自美国GIBCO公司；胰蛋白酶（Trypsin）、过氧化氢检测试剂盒购于艾美捷科技有限公司，Annexin-V/PI双染凋亡试剂盒、葡萄糖氧化酶（GOX）、Caspase-3、Bcl-2和Bax抗体购自美国Sigma公司。

1.3 萃取物对葡萄糖氧化酶活性的影响 取24孔版，每培养孔加入高糖DMEM培养基，分5组，复孔数为5，置培养箱静置1 h，各组分别加入50μL培养基、10 mU GOX、10mU GOX+25μg/mL萃取物、10 mU GOX+50 μg/m L萃取物、10 mU GOX+100μg/mL萃取物，在1、3、6、12 h按试剂盒的检测方法测量过氧化氢产生量。

1.4 细胞株及培养 人血管内皮细胞系 （EVC-304），购于中科院上海细胞库，由吉林医药学院科学实验室保存。细胞培养于高糖DMEM培养液中，培养条件为在5%CO2、湿度95%。每2天更换1次培养液，每周按1：3传代。

1.5 内皮细胞形态学观察 取对数生长期的细胞，培养24 h，分成5组，正常对照组、10 mU GOX组、10 mU GOX+25μg/mL萃取物组、10 mU GOX+50μg/mL萃取物组、10 mU GOX+100μg/mL萃取物组，用DMEM培养基稀释液分别培养24 h后，倒置显微镜下观察内皮细胞的形态学改变。

1.6 流式细胞仪检测细胞凋亡 细胞处理同 “1.4”项，12 h后用胰酶消化，PBS洗涤细胞2次，在15 000 r/m in条件下离心10min，弃去上清液；按试剂盒说明书分别加入AnnexinⅤ-FITC和PI，用流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.7 Western blot检测Caspase-3及Bcl-2和Bax蛋白表达把上述分组培养的细胞用裂解液裂解后，收集提取细胞蛋

白，使用BCA法测蛋白的量。上样量取60μg蛋白，设备为SDS-PAGE电泳仪，电转凝胶上的蛋白至PVDF膜，兔抗人Caspase-3、Bcl-2及Bax抗体稀释至1：1 000，4℃冰箱中孵育过夜，再用辣根过氧化物酶标记的二抗孵育2 h后，曝光显影。以β-actin为内参，数据以正常对照组基准，计算各个样品相对于正常对照组蛋白量的相对表达量。

1.8 统计学方法 统计分析软件为SPSS 13.0版本，不同剂量组数据先进行方差齐性检验，再进行单因素方差分析和Student-Newman-Keuls（SNK）检验。

2 结果

2.1 萃取物对葡萄糖氧化酶活性的影响 葡萄糖氧化酶在不同质量浓度萃取物条件下，产生过氧化氢的量见表1。可见与正常对照组相比，不同质量浓度萃取物和GOX组反应产生过氧化氢浓度明显增加，差异显著 （P＜0.01），同一时间点过氧化氢的量随萃取物质量浓度增加所有下降，但组间没有显著性差异，不同时间点过氧化氢的量没有显著性差异。

表1 不同萃取物质量浓度对葡萄糖氧化酶催化产生H2O2的量的影响

表1 不同萃取物质量浓度对葡萄糖氧化酶催化产生H2O2的量的影响

注：与正常对照组比较，**P＜0.01

21.5±4.3 20.9±5.1 20.3±5.3 19.4±6.2 10 mU GOX 53.3±5.2** 48.3±6.8** 50.3±4.9** 52.3±5.9**10 mU GOX+25μg/m L山核桃青皮萃取物 52.4±6.1** 49.3±4.9** 49.6±5.7** 49.5±6.3**10 mU GOX+50μg/m L山核桃青皮萃取物 50.5±5.7** 48.3±5.0** 48.7±5.8** 48.9±6.8**10 mUGOX+100μg/mL山核桃青皮萃取物 48.8±5.9** 47.1±5.6** 48.5±6.0** 50.1±6.6 1 h 3 h 6 h 12 h正常对照组组别H2O2/（μmol.L-1）**

2.2 萃取物对EVC-304细胞形态的影响 正常对照组（图1A）细胞生长良好，贴壁生长，呈多角形或长梭形，呈鹅卵石样铺满底层。而10 mU GOX组（图1B）细胞在作用24 h后，细胞胞体变小、间隙增大，细胞变圆收缩，胞浆透明，失去细胞间连接，大多数细胞悬浮脱落；不同质量浓度萃取物与10mU GOX混合培养后（图1C～图1E）细胞形态与状态与正常对照相似，但随剂量增加，细胞形态改善越好，具有剂量依赖性。

图1 各组EVC-304细胞形态（×400）

2.3 萃取物对细胞凋亡的影响 各组内皮细胞的凋亡百分比见表2，由表可见，正常对照组的凋亡最少，10 mU GOX组凋亡最多，与正常对照组比较，其它各组差异显著 （P＜0.01）；与10 mU GOX组比，其它各组差异显著 （P＜0.05，P＜0.01）；不同给药剂量组凋亡量介于正常对照组与10 mU GOX组之间，随剂量增加，凋亡增加。具有剂量依赖性。

表2 各组对EVC-304细胞凋亡的影响

表2 各组对EVC-304细胞凋亡的影响

注：与正常对照组比较，**P＜0.01；与10 mU GOX组比较，#P＜0.05，##P＜0.01

组别 细胞凋亡率/%正常对照组 3.15±1.07##10 mUGOX组 46.31±4.85**10 mUGOX+25μg/mL山核桃青皮萃取物组 9.48±3.17**##10 mUGOX+50μg/mL山核桃青皮萃取物组 18.59±5.24**##10 mU GOX+100μg/m L山核桃青皮萃取物组 32.65±6.13**#

2.4 萃取物对Caspase-3及Bcl-2和Bax蛋白表达 各组内皮细胞的Caspase-3及Bcl-2和Bax蛋白相对表达情况见图2和表3。结果可知，正常对照组与GOX组表达量存在明显差异 （P＜0.01），与正常对照组相比，不同剂量萃取物导致Caspase-3蛋白表达升高，25μg/mL组差异显著（P＜0.05）；Bcl-2蛋白表达降低，25μg/mL和50μg/mL山核桃青皮萃取物组差异显著 （P＜0.01，P＜0.05）；Bax蛋白表达升高，25μg/mL和50μg/mL山核桃青皮萃取物组差异显著（P＜0.01，P＜0.05）。与GOX组相比，使用萃取物后，Caspase-3蛋白表达下降，不同剂量给药组差异显著（P＜0.05，P＜0.01）；Bcl-2蛋白表达上升，50μg/mL和100μg/mL山核桃青皮萃取物组差异显著 （P＜0.05，P＜0.01）；Bax蛋白表达下降，100μg/mL山核桃青皮萃取物组差异显著 （P＜0.01）。随萃取物剂量增加，变化越明显，具有剂量依赖特性。

图2 萃取物对Caspase-3、BcI-2和Bax蛋白表达的影响

表3 各组Caspase-3及BcI-2和Bax蛋白相对表达量

表3 各组Caspase-3及BcI-2和Bax蛋白相对表达量

注：与10 mU GOX组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与正常对照组比较，#P＜0.05，##P＜0.01

Caspase-3 Bcl-2 Bax正常对照组10 mU GOX组组别1** 2.31±0.98##1** 0.31±0.16##1** 3.35±1.05##10 mUGOX+25μg/mL山核桃青皮萃取物组 2.01±0.87*# 0.43±0.17## 2.83±0.93##10 mU GOX+50μg/m L山核桃青皮萃取物组 1.65±0.74** 0.55±0.17*# 2.11±0.89#10 mU GOX+100μg/m L山核桃青皮萃取物组 1.29±0.34** 0.65±0.16** 1.75±0.90**

3 讨论

在体内正常水平的H2O2在具有一定意义，如参与免疫和信号传导的过程［15-18］。但在一些异常状态时，H2O2产生过多，就会产生破坏作用，损伤人体正常的组织细胞，损伤核酸结构，诱发突变及细胞凋亡等改变，进而引发老年痴呆症、心脏病、帕金森病和肿瘤等多种疾病［19-22］。在我们的研究中，针对人血管内皮细胞首次采用了酶催化，缓慢而持久的产生内源性H2O2诱导损伤，避免了外源性H2O2损伤严重且迅速消失、无法模拟体内H2O2损伤的缺点。从不同质量浓度的萃取物与GOX在高糖培养液中生成过氧化氢的实验结果看，过氧化氢的量比较稳定，至于高剂量萃取物质量浓度下过氧化氢的量的下降趋势，可能是由于酚类物质自身的抗氧化作用导致的过氧化氢分解造成的，但由于对过氧化氢的量的影响尚未达到显著的差异，该损伤模型可以用于实验研究。实验结果也显示：加入GOX后，细胞形态上改变明显，流式结果也显示细胞出现大量的凋亡，说明，加入GOX后，可以有效的模拟内源性H2O2损伤造成的凋亡。使用不同质量浓度的萃取物进行干预的结果表明，核桃青皮萃取物对内源性H2O2损伤导致的凋亡作用具有抑制作用，说明萃取物对由内源性H2O2损伤的血管内皮细胞具有保护作用，并且在一定剂量范围内，质量浓度越高抑制作用也越强，说明这种保护作用有一定的剂量依赖特点。同时我们也观察到萃取物干预后，Caspase-3及Bax蛋白表达下降、Bcl-2蛋白表达增加，这说明，萃取物的保护作用与对凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax表达的调节以及Caspase凋亡通路有关，而且这种变化也具有剂量依赖的特点，说明萃取物可以影响凋亡相关蛋白的表达，实现对凋亡通路的调控。Bax蛋白在对Caspase凋亡通路的影响上，表现为促进凋亡的发生，其表达的增加会增加Bax蛋白的同源结合，激活Caspase凋亡通路，引发凋亡。而Bcl-2蛋白与Bax竞争异源结合，抑制Bax蛋白对Caspase凋亡通路的激活，发挥对H2O2损伤细胞的保护作用。实验中Caspase-3蛋白表达下降的结果也说明，除了上述的抑制凋亡作用外，其还可以通过下调Caspase凋亡通路的蛋白，来实现对细胞的保护作用。但这两种作用之间有无相互影响，以及是否还有其他的原因，仍然需要进一步的研究。

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R285.5

B

1001-1528（2015）11-2511-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.11.039

2014-10-15

吉林省科技厅科技发展项目 （20130101157JC）；吉林省教育厅 “十二五”科学技术研究项目 （2012-334）；吉林省教育厅“十二五”科学技术研究项目 （2014-363）

赵行宇（1970—），男，硕士，副教授，研究方向为抗氧化应激中药筛选。Tel：13844239332，E-mail：jlmmczw@163.com