芎麻滴丸对血管性认知障碍过程中细胞凋亡及Caspase-3、Fas蛋白的影响

刘 琳， 盖祥云， 周 游， 赵 瑛， 王淑静

（哈尔滨商业大学药学院，黑龙江哈尔滨150076）

芎麻滴丸对血管性认知障碍过程中细胞凋亡及Caspase-3、Fas蛋白的影响

刘 琳， 盖祥云， 周 游， 赵 瑛*， 王淑静

（哈尔滨商业大学药学院，黑龙江哈尔滨150076）

目的 探讨芎麻滴丸对脑缺血致血管性认知障碍（VCI）发病过程中神经元细胞凋亡和Caspase-3、Fas凋亡蛋白动态变化的干预机制。方法 采用永久性结扎双侧颈总动脉 （2-VO）的方法建立VCI大鼠模型，于模型建立前3 d给予不同剂量的芎麻滴丸及阳性对照药，分别于术后7、14、28、42 d采用TUNEL法检测海马CA1区神经元凋亡，用免疫组织化学法检测脑组织Caspase-3、Fas蛋白表达。结果 与假手术组相比，7、14、28、42 d模型组大鼠海马中均出现凋亡细胞 （P＜0.01），7、28、42 d模型组Caspase-3阳性表达显著升高 （P＜0.01），14 d和28 d模型组Fas阳性表达显著升高 （P＜0.05，P＜0.01）；与模型组相比，7、28、42 d时芎麻滴丸0.375～1.5 g/kg剂量组和银杏叶片组，14 d芎麻滴丸0.375 g/kg剂量组和银杏叶片组凋亡细胞均显著减少 （P＜0.01），与模型组相比，除7 d银杏叶片组和14 d芎麻滴丸1.5 g/kg组外，7、14、28、42 d芎麻滴丸0.375～1.5 g/kg组及银杏叶片组Caspase-3阳性表达均显著降低 （P＜0.05，P＜0.01），14、28 d芎麻滴丸0.375～0.75 g/kg量组和银杏叶片组，28 d芎麻滴丸1.5 g/kg剂量组Fas阳性表达显著降低（P＜0.05，P＜0.01）。结论 脑缺血致VCI过程中会通过Fas信号途径伴随有诱导细胞凋亡，且Fas的过度表达时间早于Caspase-3。芎麻滴丸可以抑制VCI发病过程中细胞凋亡的发生，其机制与抑制凋亡蛋白Caspase-3、Fas有关，以芎麻滴丸0.375 g/kg剂量效果最为显著，在脑缺血初期使用药物进行干预更有助于延缓或阻止VCI的发生。

血管性认知障碍，永久性结扎双侧颈总动脉，细胞凋亡，Caspase-3蛋白酶，Fas蛋白酶

血管性认知功能障碍（vascular cognitive impairment，VCI）是指一组以脑血管病危险因素，明显或不明显的脑血管病引起的从轻度认知障碍到痴呆的一大类认知损害综合征［1-2］。采用2-VO法可以导致大鼠慢性前脑血流灌注不足，造成一种慢性脑低灌注状态，造模后可以使脑组织产生缺血、缺氧性损害［3-4］。本项目前期研究表明，VCI发生过程中大鼠海马中CytoC、Bcl-2、Bax会发生一系列改变，使用芎麻滴丸进行早期干预可以逆转这种情况的发生［5-6］。那么这些重要的凋亡蛋白是否会引起最终细胞凋亡的发生？Caspase-3、Fas等下游相关蛋白又是如何改变的？这些都将是本实验研究的重点。

本实验采用2-VO方法建立VCI模型，分别于模型建立后7、14、28、42 d测定VCI大鼠神经元细胞凋亡情况，并于模型建立前3 d给予中药复方制剂——芎麻滴丸，研究芎麻滴丸对VCI发病过程中大鼠神经元细胞凋亡及凋亡蛋白Caspase-3、Fas的干预情况。本实验根据VCI发病过程中神经元细胞凋亡及Caspase-3、Fas蛋白的变化，探讨VCI发病的关键时间点，推测VCI治疗的最佳时间窗，并探讨细胞凋亡可能的产生机制，同时结合前期研究探讨VCI引起细胞凋亡的动态变化规律；另一方面通过研究芎麻滴丸对VCI发病不同阶段细胞凋亡及Fas蛋白的影响，寻找有针对性的VCI预防用药。

1 材料

1.1 试验药物 芎麻滴丸成型前液体：哈尔滨商业大学药学院实验室制备［7］（川芎总酚酸和天麻总苷≥37.77%）。浓缩制成相当于1 g/mL生药的溶液，保存于4℃冰箱备用。银杏叶片 （产品批号0907081）购自广西亿康药业股份有限公司。

1.2 动物 成年健康SD雄性大鼠 （12～14周龄）230只，体质量为300～350 g，由黑龙江中医药大学实验动物中心提供。合格证号0102009。

1.3 试剂 Caspase-3兔抗大鼠多克隆抗体（产品批号09D01）、Fas兔抗大鼠多克隆抗体 （产品批号08G02）均购自武汉博士德生物工程有限公司；水合氯醛 （产品批号

060707）购自上海化学试剂公司。

1.4 仪器 Leica RM2135石蜡切片机（德国莱卡公司）；光学显微镜（日本Olympus BH-2型）。

1.5 方法

1.5.1 VCI模型的复制 永久性结扎双侧颈总动脉（2-VO）方法：用10%水合氯醛 （3 mL/kg体质量）腹腔注射麻醉大鼠，取颈正中切口，分离双侧颈总动脉并结扎［8］。

1.5.2 实验动物分组及给药 按动物体质量将动物随机分为：假手术组 （生理盐水10 mL/kg），模型组 （生理盐水10 mL/kg），芎麻滴丸低剂量组 （相当于生药0.375 g/kg），高剂量组 （相当于生药1.5 g/kg）、中剂量组 （相当于生药0.75 g/kg）和银杏叶片组（61.359 mg/kg）。每组动物分别于造模后第7、14、28、42天取材。模型复制前3 d开始灌胃给药，2次/d。

1.5.3 TUNEL法检测细胞凋亡率 分别于造模后7、14、28、42 d，大鼠末次给药45 min后断头处死，分开大鼠颅骨，迅速在冰盘上取出大脑，正中对称切开，将左侧大脑组织用4%多聚甲醛溶液固定，并进行脱水、透明、浸蜡、包埋，制作石蜡切片。脱蜡后采用末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）介导的原位末端标记法 （TUNEL）测定凋亡率，按检测试剂盒说明书进行，阴性对照组用PBS代替一抗。最后脱水、透明、封片。光镜下观察，细胞核呈棕黄色为凋亡细胞，同一部位HE染色组织切片在同一放大倍数下随机选取10个视野计算TUNEL染色阳性凋亡神经元细胞个数。

1.5.4 免疫组化法分别检测大鼠海马中Caspase-3及Fas表达 各组于模型复制后各时间点给药后处死，取左侧大脑制作石蜡切片。石蜡切片常规免疫组化处理，兔抗鼠Caspase-3（1：150）；兔抗大鼠Fas（1：100）一抗；中性树脂封片保存。BI-2000免疫组化图像分析系统分析每张切片10个视野下光密度值，并求取其平均值。

1.5.5 统计方法 数据用SPSS 18.0统计软件进行方差分析和多组间比较，以P＜0.05为差异具有显著性意义，P＜0.01为差异具有非常显著性意义。

2 结果

2.1 TUNEL检测凋亡率的结果 光镜下观察，TUNEL染色阳性凋亡神经元的细胞核呈棕黄色，阴性对照组无黄色或棕黄色染色。假手术组大鼠海马组织中只有零星的凋亡神经元。模型组大鼠海马各区中均出现大量细胞核呈现棕黄色的神经元细胞，细胞排列不规则，细胞体积缩小，提示为凋亡细胞。7、14、28、42 d芎麻滴丸低、中剂量组中海马区内凋亡细胞数量较模型组明显减少，阴性神经元细胞较多。

与假手术组相比，7、14、28、42 d模型组海马中均出现大量凋亡神经元细胞 （P＜0.01）；与模型组相比，14 d时芎麻滴丸低剂量组和银杏叶片组凋亡细胞均显著减少（P＜0.01），14 d时芎麻滴丸中、高剂量组凋亡细胞也有一定程度减少，但无显著性差异 （P＞0.05），7、28、42 d时芎麻滴丸低、中、高剂量组和银杏叶片组凋亡细胞均显著减少 （P＜0.01）。结果见表1。

表1 各组大鼠脑组织海马TUNEL阳性表达结果

表1 各组大鼠脑组织海马TUNEL阳性表达结果

注：与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与假手术组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01

7 d 14 d 28 d 42 d假手术组 —组别 剂量/（g.kg-1）9.50±1.87 8.00±1.41 8.00±2.37 9.00±1.41模型组 — 30.33±1.63△△ 12.83±3.19△△ 31.83±3.06△△ 31.17±2.32△△芎麻滴丸组 0.375 16.17±2.32** 9.00±2.61** 15.50±1.87** 14.33±2.16**芎麻滴丸组 0.75 18.57±1.99** 10.33±2.51 20.67±2.16** 19.33±1.75**芎麻滴丸组 1.5 22.83±2.64** 11.17±1.94 23.67±3.33** 23.67±4.76**银杏叶组 0.061 15.83±1.94** 8.00±1.41** 16.50±1.52** 16.33±2.16**

2.2 各组大鼠脑组织海马区Caspase-3阳性表达 阴性对照组未出现阳性表达。假手术组大鼠海马区可见少量胞浆中出现浅黄色颗粒的神经细胞，7、28、42 d模型组大鼠海马中均可见大量胞浆或胞核出现黄色或棕黄色颗粒的神经元细胞。芎麻滴丸低、中、高剂量组和银杏叶片组均可不同程度的降低大鼠脑组织海马神经元细胞Caspase-3阳性表达。

与假手术组相比，7、28、42 d模型组Caspase-3阳性表达显著升高 （P＜0.01）；与模型组相比，除7 d银杏叶片组和14 d芎麻滴丸高剂量组外，7、14、28、42 d芎麻滴丸低、中、高剂量组及银杏叶片组Caspase-3阳性表达均显著降低 （P＜0.05，P＜0.01），其中以28 d芎麻滴丸中剂量组降低最显著，但结果并无统计学意义 （P＞0.05）。结果见表2。

表2 各组大鼠脑组织海马Caspase-3阳性表达结果

表2 各组大鼠脑组织海马Caspase-3阳性表达结果

注：与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与假手术组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01

7 d 14 d 28 d 42 d假手术组 —组别 剂量/（g.kg-1）0.217±0.034 0.240±0.043 0.181±0.031 0.166±0.054模型组 — 0.314±0.041△△ 0.250±0.018 0.306±0.054△△ 0.312±0.066△△芎麻滴丸组 0.375 0.189±0.036** 0.207±0.033* 0.219±0.037** 0.202±0.012**芎麻滴丸组 0.75 0.260±0.033** 0.205±0.060* 0.183±0.060** 0.226±0.029**芎麻滴丸组 1.5 0.276±0.042* 0.248±0.017 0.260±0.071** 0.248±0.041**银杏叶组 0.061 0.331±0.079 0.168±0.036** 0.222±0.026** 0.197±0.079**

2.3 各组大鼠脑组织海马区Fas阳性表达 阴性对照组未出现阳性表达。Fas以胞浆表达为主，呈现黄色或棕色颗粒状。与假手术组相比，7、14、28、42 d模型组海马区阳性细胞数增多着色增强，其中以28 d模型组最为显著；而各治疗组与模型组相比，阳性表达均有不同程度的降低。

与假手术组相比，14 d模型组海马区Fas阳性表达升高 （P＜0.05），28 d模型组海马区Fas阳性表达显著升高（P＜0.01），7 d和42 d模型组Fas阳性表达也有一定升高，但无统计学意义；与模型组相比，14 d银杏叶片组Fas阳性表达降低 （P＜0.05），14 d芎麻滴丸低、中剂量组Fas阳性表达显著降低 （P＜0.01），28 d芎麻滴丸低、中、高剂量组和银杏叶片组Fas阳性表达显著降低 （P＜0.01）。结果见表3。

表3 各组大鼠脑组织海马Fas阳性表达结果

表3 各组大鼠脑组织海马Fas阳性表达结果

注：与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与假手术组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01

7 d 14 d 28 d 42 d假手术组 —组别 剂量/（g.kg-1）0.298±0.024 0.291±0.012 0.339±0.044 0.289±0.064模型组 — 0.326±0.023 0.383±0.042△ 0.470±0.063△△ 0.341±0.030芎麻滴丸组 0.375 0.281±0.031 0.305±0.036** 0.329±0.042** 0.306±0.049芎麻滴丸组 0.75 0.292±0.026 0.290±0.015** 0.320±0.037** 0.295±0.025芎麻滴丸组 1.5 0.373±0.029 0.327±0.035 0.350±0.034** 0.343±0.037银杏叶组 0.061 0.337±0.025 0.308±0.028* 0.336±0.042**0.303±0.096

3 讨论

脑缺血性脑血管病是血管性认知法障碍发生的主要原因。2-VO法是以慢性低灌注引起脑缺血缺氧，最终导致神经细胞功能下降，并引起学习记忆障碍的VCI模型建立方法［8］。本试验从结果上也印证了这一说法。本实验研究发现，模型复制第7天，大鼠即出现明显的细胞凋亡，但7 d后，大鼠神经元细胞凋亡情况又有所恢复。有文献报道2-VO 24 h后大鼠脑血流量迅速下降，1～2周内大鼠脑血流量逐渐恢复，并与2周时脑血流量恢复达高峰，这与本研究的时间点一致［9］。推测这段时期很可能是急性缺血期和慢性缺血期之间的分水岭。随着时间的延长，脑缺血28 d和42 d时，大鼠神经元继续凋亡，且凋亡程度有所增加，这可能是导致大鼠最终出现VCI的原因之一。

细胞凋亡是缺血性认知障碍的主要病理生理机制之一，本实验研究发现脑缺血后14 d及28 d，Fas过度表达，其中以28 d表达更为明显。而Caspase-3则在28 d及42 d时过度表达，Fas的高表达时间早于Caspase-3高表达时间，Caspase-3的高表达与细胞凋亡正相关。此结果提示，作为一种重要的死亡受体，Fas可以通过Fas信号途径最终激活凋亡效应分子Caspase-3而促发凋亡。这一现象也与文献报道相吻合［10-11］。

结合前期实验［3］发现，作为细胞凋亡的关键节点，细胞凋亡的线粒体途径、内质网途径和死亡受体途径对会对Caspase-3的变化产生影响。本实验研究发现脑缺血后28 d及42 d，Caspase-3过度表达，这与细胞凋亡的第二个高峰相吻合。而Caspase-3变化后将导致细胞释放CAD，从而降解DNA，导致细胞凋亡。随着时间的延长，脑缺血28 d和42 d时，大鼠神经元继续凋亡，且凋亡程度有所增加，这可能是导致大鼠最终出现VCI的原因之一。

芎麻滴丸是传统中药复方芎麻汤经现代工艺提取分离并纯化的中药复方现代制剂，前期试验表明芎麻滴丸可以改善2-VO所致的大鼠学习记忆障碍。本实验研究发现，芎麻滴丸高、中、低剂量均可以改善大鼠脑缺血后7、28、 42 d所产生的细胞凋亡，其中以芎麻滴丸低剂量组作用最强，这与前期研究结果一致［12］。芎麻滴丸低剂量在缺血早期下调Fas作用最强，随着缺血时间延长，在缺血的中后期进一步抑制由Caspase-3诱导的细胞凋亡的发生，并于脑缺血后42 d抑制细胞凋亡达高峰。芎麻滴丸中、高剂量在脑缺血的中后期可以抑制Fas高表达，进而通过Caspase级联反应抑制细胞凋亡。而芎麻滴丸低剂量改善大鼠学习记忆障碍最为显著，因此推测芎麻滴丸预防大鼠VCI的过程与其抑制大鼠神经元细胞凋亡有关，其作用机制可能是抑制Fas蛋白的过度表达，且在脑缺血初期使用药物进行干预更有助于延缓或阻止VCI的发生。

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R285.5

B

1001-1528（2015）11-2505-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.11.037

2014-07-05

国家自然科学基金项目 （81373548）；黑龙江省自然科学基金 （H201382）

刘 琳（1978—），女，博士，副教授，研究方向为神经药理学。Tel：15004658705，E-mail：liulinyx@163.com

*通信作者：赵 瑛 （1960—），女，博士，教授，研究方向为中药防治重大疾病。Tel：13936678930，E-mail：zhaoy0204@163.com

日期：2014-12-01

网络出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/31.1368.R.20141201.1553.002.html