用于肿瘤治疗的小分子干扰RNA非病毒载体研究进展

王 欢1，马志强2，杨 峰2（1.福建中医药大学药学院，福建 福州 350122；2.第二军医大学药学院无机化学教研室，上海 200433）

·综述·

用于肿瘤治疗的小分子干扰RNA非病毒载体研究进展

王 欢1，马志强2，杨 峰2（1.福建中医药大学药学院，福建 福州 350122；2.第二军医大学药学院无机化学教研室，上海 200433）

近年来，小分子干扰RNA（s i RNA）作为RNA干扰（RNA i）技术的效应分子，已被广泛用于恶性肿瘤的基因治疗领域。欲获得理想的治疗效果，其关键因素是寻找一种安全、高效、稳定、可控的基因载体。非病毒载体具有低毒、低免疫原性、制备简单、目的基因容量大、外源基因随机整合率低且携带基因大小类型不受限制等突出优势，已经成为目前siRNA载体的研究热点。在以往学者的研究基础上，从药剂学的角度，笔者对这些载体在siRNA传递系统中的研究现况做回顾性总结。

RNA干扰；小分子干扰RNA；肿瘤；基因治疗；非病毒载体

RNA干扰（RNA interference，RNAi）技术是指在进化过程中高度保守的由双链RNA（doublestranded RNA，dsRNA）诱发的同源mRNA高效特异性降解的现象。利用RNAi技术可通过外源性或内源性dsRNA诱导内源靶基因的mRNA降解，特异性地抑制靶基因表达［1］。近年来，该技术已被广泛应用于肿瘤基因治疗、基因功能探索及传染性疾病防治等领域。肿瘤的发生与基因异常有着密切联系，RNAi技术也被认为是未来肿瘤基因治疗最有可能取得突破性进展的方向之一。但同时由于siRNA在生物体内极易被核酸酶降解、肾小球存在的滤过清除效应，以及siRNA的负电性及尺寸原因，很难跨越同样表现为负电性的细胞膜［2］。因此，如何使siRNA准确到达靶组织和细胞是目前应用RNAi面临的巨大挑战，也是近年来药剂学领域的研究热点。

常见的siRNA载体分为病毒载体和非病毒载体两大类。病毒载体常见的有：小鼠逆转录病毒（murine retroviruses）、慢病毒（entiviruses）和腺相关病毒（adeno-associated virus）载体等，具有较高的转染效率，但同时存在大规模制备困难、包载容量小、特异性差和生物安全性等问题，限制了其应用。相对而言，非病毒载体具有低毒、低免疫原性、制备简单、目的基因容量大、外源基因随机整合率低且携带基因大小类型不受限制等突出优势，是目前公认的优良siRNA载体。已得到广泛研究的siRNA非病毒载体包括：阳离子脂质体及脂质复合物、阳离子聚合物、阳离子多肽和无机纳米粒等。本文从药剂学的角度对上述siRNA非病毒载体的研究现况进行综述，并简单介绍其在肿瘤治疗领域的初步应用。

1 阳离子脂质体及脂质类似物

阳离子脂质体（cationic liposome）凭借其制备简单、可重复转染、免疫原性低和可降解等特点，已成为应用最为广泛的一类非病毒基因载体。阳离子脂质体通常是由带正电的磷脂和中性的辅助脂类组成。带正电的磷脂结构通常分为阳离子头部、骨架链、连接键和疏水尾部4个部分。亲水头部主要由含氮杂环类、季胺类、聚氨酯类和胍盐类等组成，氮杂环类阳离子头部比直线型伯胺和聚胺的转染效率高且细胞毒性低［3］。骨架链主要以丙三醇或者氨基酸结构作为“Y”关节连接疏水部分与阳离子头基，影响siRNA的释放与内涵体的逃离。连接键常为酰胺键、氨基甲酸酯键等化学性质稳定且可降解的基团。疏水尾部长度主要影响脂质的相转变温度、转染效率和细胞毒性。研究表明，相对较长的脂肪碳链其相转变温度高、硬度大，基因转染效率也差［4］。Han等［5］以胆固醇衍生物作为阳离子脂质的疏水尾部，构建了血清增强型的siRNA传递系统，增加了在靶位的生物分布。Maslov等［6］合成了以精胺为头部，胆固醇为尾部，氨基甲酸为连接键，6个亚甲基为骨架的Gemini型两亲性阳离子脂质，在体外具有较好的转染效果。常见的辅助脂类包括：二油酰磷脂酰乙醇胺（DOPE）、磷脂酰胆碱（PC）、胆固醇（Chol）等，能够起到稳定脂质双分子层，降低阳离子脂质毒性的作用。

2 阳离子多聚物

2.1 聚乙烯亚胺 聚乙烯亚胺（po l yethy l enimine，PEI）是目前运用最为广泛的阳离子多聚物，也是基因递送中的“金标准”载体材料，在生理条件下显正电性，可与核酸链上负电性的磷酸根静电结合并包裹，高度压缩核酸形成复合物。重复的乙二胺结构单元使其具有强大的缓冲能力和“质子海绵”效应，在低pH值的内涵体环境中，氨基质子化，复合物内的排斥作用增强，孔径增大。大量捕获质子的同时引起Cl－内流，导致溶酶体肿胀破裂，从而将内吞的基因药物释放到细胞质中。

但是PEI具有的较强细胞毒性限制了其应用，目前常通过化学修饰等方法改善其性能。例如，在PEI上接枝PEG链可显著降低复合物的表面电荷，保护siRNA免受酶解。Kim等［7］合成了PEI-g-PEG-RGD／siRNA复合物，在20%胎牛血清中能够保持结构稳定、完整6h以上，这有利于复合物经历长时间的血液循环到达肿瘤组织，增加氮／磷比（N／P）值，使复合物表面正电性增加，利于肿瘤细胞的摄取。Malek等［8］也考察了PEI-PEG／siRNA复合物在小鼠体内的药动学参数和组织分布，结果显示，较高N／P值的复合物在肺中会引起红细胞聚集和溶血现象，最适宜的N／P值在9～30之间。Xia等［9］利用含二硫键的PEI（ss-PEI）实现了hTERT siRNA的选择性细胞内释放，降低了hTERT mRNA及hTERT蛋白的表达水平，降低了端粒酶的活性，抑制了HepG2细胞的生长，显著诱导细胞凋亡，同时ss-PEI表现出很低的体外细胞毒性。

2.2 树状聚合物 聚酰胺-胺树状大分子（polyam idoamine dendrimer，PAMAM）表面众多的正电氨基基团能有效绑定并压缩核酸，防止siRNA酶解，在酸性条件下释放siRNA。PAMAM具有大量的端基官能团，通过对端基官能团的改性［10］可以得到具有不同性能的树状大分子。近年来，研究者们常将PAMAM载有siRNA后，再利用胶束等包裹PAMAM-siRNA复合物，最后与化疗药物形成共载药系统，达到药物的协同治疗目的。Biswas等［11］首先合成了G（4）-D-PEG-（2K）-DOPE三嵌段共聚物，包载siRNA后再以PEG-PE胶束包裹，结果显示，提高了细胞对siRNA的摄取和阿霉素的包封率，这种化疗药物与siRNA的共载物为治疗多药耐药性肿瘤提供了性质优良的载体。Perez等［12］用泊洛沙姆等包裹载有siRNA的PAMAM复合物制备出原位凝胶，利用鼻-脑通道传递，越过血-脑屏障，有望用于脑胶质瘤的治疗。

2.3 聚赖氨酸 聚赖氨酸（polylysine，PLL）是碱性氨基酸赖氨酸的聚合物，也是在基因载体中被研究较早的聚合物之一。PLL侧链上的伯胺质子化后，成为结合核酸的位点，具有极好的核酸浓缩能力和较好的生物相容性和可降解性。目前常将其用PEG、聚乙二醇单甲醚（MPEG）等亲水性修饰，或与聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）形成PEG-PLGAPLL三嵌段共聚物，达到共载化疗药物与siRNA的目的［13］。Ambardekar等［14］制备了胆固醇修饰的siRNA与PEG-PLL的复合物（Chol-siRNAPEG-PLL），有效防止了siRNA的酶解并增强了对mRNA的抑制效率。Christie等［15］合成了多功能的PEG-PLL共聚物，通过连接环状RGD肽（cRGD），增加其在肿瘤组织的聚集和肿瘤细胞的摄取，提高了基因沉默能力。

3 天然高分子材料

3.1 壳聚糖 Mumper［16］于1995年首次将壳聚糖（chitosan，CS）用作非病毒基因载体。壳聚糖是天然的碱性多糖，具有良好的生物相容性、可降解性和独特的跨膜转运能力，但同时由于其溶解性较差，导致转染效率低，单独使用时效果不显著。目前，常用作载体的是壳聚糖的改性衍生物，如季铵化的壳聚糖、羧甲基壳聚糖、PEG化的壳聚糖、壳聚糖-g-聚乙烯亚胺、十二烷基化壳聚糖等。Zhou等［17］设计出一种可作为蛋白激酶底物的短肽，与壳聚糖偶联，进入细胞后，可被蛋白激酶磷酸化，使得短肽-CS所包裹的siRNA释放，提高了CS／siRNA的转染效率。Pezzoli等［18］合成了7个接枝率不同的壳聚糖-g-聚乙烯亚胺共聚物，结果发现N／P＝30的Chi-g-bPEI转染效率与PEI相当，但细胞毒性较低。

3.2 环糊精 环糊精（cyc l odex t r in，CD）是直链淀粉在芽孢杆菌产生的环糊精葡萄糖基转移酶作用下生成的一系列环状低聚糖的总称。2009年，Davis等［19］首次报道了环糊精包载siRNA后制成靶向纳米粒的临床试验研究。Hu等［20］研发载雷公藤甲素与siRNA的PEI-CD的传递系统，结果显示，雷公藤甲素的结合率可达10%，siRNA也在N／P＝5时被成功压缩，复合物粒径约300nm，Zeta电位约＋8m V，体外实验也显示出良好的抑制肿瘤生长与转移的作用。Boe等［21］利用光化学内化技术（photochemical internalization，PCI）调节siRNA-环糊精聚合物的基因表达，PCR实验结果显示，基因沉默效率为80%～90%，且在逃离内涵体5h后，实现了最大的基因沉默效果。

4 细胞穿膜肽

细胞穿膜肽（cell-penetrating peptides，CPP）是一类具有很强细胞膜穿透能力的多肽，常见的有如TAT、MPG、PEP-1、聚精氨酸等，能促进细胞摄取蛋白质、多肽、核酸片段等分子而不损坏细胞结构。大多数CPP-核酸复合体都是通过共价键结合，其中最常用的是二硫键，其他较稳定的连接键有：酰胺键、噻唑烷、肟和肼键等。

人类免疫缺陷病毒（HIV-1）的反式激活蛋白（trans-activator transcription，TAT）能高效、快速地跨膜转运与其融合表达的载体并使之进入细胞，对细胞无损伤。Fang等［22］合成了对血管内皮细胞因子受体1（VEGFR-1）具有高亲和力的六氨基酸肽A1的TAT-A1肽，并成功将siRNA转染入人HepG2细胞。Choi等［23］在小鼠体内实验中发现，低分子量的鱼精蛋白可有效传递siRNA并定位于肿瘤，且抑制了血管内皮生长因子（VEGF）的表达。近年来发现的iRGD的多肽（CRGDK／RGPDC）在具有整合素受体αvβ3靶向功能的同时，还可与肿瘤细胞表面的NRP-1受体相互作用，介导细胞膜穿透效应，加速药物传递，进入肿瘤细胞，是极具运用前景的一类靶向穿膜肽［24］。

5 无机纳米粒

无机纳米材料制备简单，具有良好的生物相容性和可降解性，稳定性好，作为基因载体，能包裹、浓缩、保护核酸免受核酸酶的降解，并可介导目的基因在靶细胞内表达。目前研究较多的无机载体主要有：羟基磷灰石纳米颗粒（hydroxyapatite nanoparticles，HAP）、介孔二氧化硅纳米颗粒（mseoporous silica nanoparticles，MSN）、磁性氧化铁颗粒和金纳米颗粒等。HAP是人和动物骨骼及牙齿的主要成分，分子式为Ca10（PO4）6（OH）2，具有极好的生物相容性，可结合、保护siRNA实现透膜表达。Liang等［25］用HAP传递针对STAT3的siRNA，可阻断STAT3信号通路，小鼠前列腺肿瘤组织中的STAT3及其下游基因Bcl-2、VEGF和细胞周期蛋白的表达都被显著抑制。MSN是一类有序排列的介孔结构，属粒径在纳米尺度的无机非金属材料，具有很高的比表面积和孔容。同时，其表面具有大量的硅醇基，可用于进一步的化学修饰。例如，Li等［26］合成了PEI与融合肽修饰的磁性MSN（MMSN_siRNA＠PEI-KALA），体外抑制A549细胞效果良好。此外，该复合物对VEGF具有较好的RNA干扰作用，瘤内注射也可抑制新生肿瘤血管的生成。

6 总结与展望

siRNA药物易于合成与实现生产，应用前景十分诱人。目前RNAi技术已成功应用于慢性粒细胞白血病、老年性黄斑病变、呼吸道病毒感染和急性肾功能衰竭等疾病的治疗研究。但是，目前用于肿瘤治疗的siRNA药物多还处于临床试验阶段，距离产品真正上市还有一定距离。

随着对基因表达机制及体内过程认识的不断深入，人们也认识到存在阻碍RNAi发展的种种问题，提升治疗效果的关键还是需要性质优良的载体“护送”基因治疗药物到达靶标。材料科学的发展突飞猛进，新型安全有效的材料不断地被发现或合成。阳离子聚合物、融合多肽、无机纳米粒等作为载体的优势也在逐渐体现。如何利用这些材料开发安全有效、稳定可控、靶向智能的传递系统仍将是今后的研究热点。除此之外，基于RNA治疗的生物体内机制，时效-量效关系，合适的给药剂型和剂量，载体在亚细胞的阻碍，避免脱靶效应等问题仍需进一步研究与解决。

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Current status of non-viral siRNA vectors for therapy of cancers

WANG Huan1，MA Zhiqiang2，YANG Feng2（1.School of Pharmacy，Fujian University of Traditional Chinese Medicine，Fuzhou 350122，China；2.Department of Inorganic Chemistry，School of Pharmacy，Second M ilitatry University，Shanghai 200433，China）

In the recent years，siRNA has been w idely used as effectormolecule in the field of gene therapy for cancer.In order to achieve ideal treatment effect，the key factor is to find safe，efficient，stable and controllable gene vectors.The commonly used vectors include viral and non-viral vectors.The non-viral gene vector has superiority of low toxicity，bare immunogenicity，simple to manufacture and high capacity which have been taken as the highlightof the research of carrier of gene drugs.Based on the study of the previous researchers，this study reviewed the prevalence study of the former carriers in the delivery system of siRNA from the point of pharmaceutics.

RNAi；siRNA；tumor；gene therapy；non-viral vector

R737.2；Q78

A

1006-0111（2015）06-0498-04

10.3969／j.issn.1006-0111.2015.06.005

2014-02-21

2015-03-05［本文编辑］李睿旻

王 欢，硕士研究生.研究方向：药物缓控释给药系统.E-mail：wang568855641＠163.com

杨 峰，副教授，硕士生导师.研究方向：药物缓控释给药系统.E-mail：yangfeng1008＠126.com