β-樱草糖苷酶对茶叶醇系香气的影响研究进展

邓慧莉，孙 云，赖钟雄

(福建农林大学园艺学院，福建 福州350002)

茶叶以其独特的香气滋味而名闻天下。香气是茶叶品质的重要衡量指标，20 世纪50年代中期开始对茶叶香气展开较为系统的研究［1－3］。由于技术与设备的限制，早期研究仅局限于茶叶香气的提取方法及组分鉴定等。近年来，由于微量分析技术的快速发展，对茶叶加工和贮藏中的香气变化、不同茶类和品种的香气差异以及香气形成机理等方面都展开了研究［4－7］。

茶叶香气的合成途径较为复杂，在已知的香气形成途径中，由糖苷类物质水解生成相应的醇类物质受到广泛关注。国内外研究表明［8－11］，β-樱草糖苷是茶叶醇系香气物质的重要前体，β-樱草糖苷酶水解β-樱草糖苷的过程对茶叶醇系香气的形成具有关键作用。本文综述了β-樱草糖苷酶对醇系香气影响的研究进展，并展望了β-樱草糖苷酶的应用前景，以期为β-樱草糖苷酶的深入研究提供依据。

1 茶叶醇系香气的形成

醇类化合物种类和相对含量在各茶类中均较高，其中橙花叔醇、植醇、芳樟醇及其氧化物、脱氢芳樟醇、香叶醇、苯乙醇、雪松醇、异植醇是各茶类共有的香气成分。各茶类主要特征香气物质不同，如红茶香气的萜烯醇类物质主要有芳樟醇、香叶醇、橙花醇等。

茶叶中醇类化合物的形成与转化有多条途径，制茶发酵过程的酶促氧化作用引起一系列次生氧化与伴随作用［12］。茶叶中包括游离态、结合态两种醇系香气，醇系香气的主要来源是结合态香气，包括萜烯醇类和芳樟醇类化合物，它们在茶鲜叶中基本以糖苷形式存在［13］。糖苷酶类能有效水解糖苷类香气前体，并释放出相应的醇系香气。

1.1 糖苷类香气前体

1.1.1 茶叶中的糖苷类香气前体 糖苷类香气前体是以与单糖或双糖结合的配基形式存在。目前已有20 多种糖苷类香气前体得到分离鉴定，大部分是二糖苷和单糖苷，其中以β-樱草糖苷为主的二糖苷含量高于以β-葡萄糖苷为主的单糖苷［11，14，15］。Guo et al［16］首次从茶叶中分离得到香气前体香叶基-β-樱草糖苷。Moon et al［17］从茶叶中分离出顺、反式芳樟醇氧化物和8-羟基牻牛儿基-β-樱草糖苷。Yano et al［18］、Kobayashi et al［19］、Nishikitani et al［20］、Guo et al［21］、Sakata et al［22－23］、Ma et al［24］、张正竹等［25］利用柱层析法分离茶叶中的β-樱草糖苷，发现主要苷元是顺-3-己烯醇、芳樟醇及其氧化物，并且结合在β-樱草糖苷的苷元多于β-葡萄糖苷，说明β-樱草糖苷是茶树中更为重要的前体物质。Wang et al［26］测定红茶加工过程中β-樱草糖苷酶和β-葡萄糖苷酶活性的变化，发现β-樱草糖苷酶的活性及释香能力均比β-葡萄糖苷酶强。Yang et al［27］在绿茶加工过程中添加外源β-樱草糖苷酶和β-葡萄糖苷酶，研究酶对香气释放的影响，认为β-樱草糖苷酶释香能力比β-葡萄糖苷酶强，这与Wang et al［26］的研究结果一致。

1.1.2 茶叶加工中糖苷类香气前体的变化 糖苷类香气前体的含量与加工过程紧密联系。Fischer et al［28］认为许多糖苷类香气前体未被水解，有些鲜叶中并不存在的前体物质在加工过程中逐渐形成，说明茶叶加工过程存在糖苷的合成反应。Wang et al［14］研究了红茶加工中糖苷含量的变化趋势，发现鲜叶中樱草糖苷的含量远远高于葡萄糖苷，成品茶中樱草糖苷含量很低，而葡萄糖苷含量却达到鲜叶含量的70%，说明β-樱草糖苷是红茶的主要香气前体物质。乌龙茶晒青过程中，很多糖苷类物质含量上升，成品茶的糖苷达到最高值［26］。张正竹等［29］检测绿茶加工中糖苷含量变化，认为成品绿茶保留鲜叶中77%的香气前体物质。

1.2 茶叶中的糖苷酶类

分布于茶叶细胞中的糖苷酶种类丰富，其中香气形成的关键酶是β-樱草糖苷酶、β-葡萄糖苷酶和β-半乳糖苷酶［30］。

Sakata et al［31］通过纯化茶鲜叶粗酶提取物，得到β-半乳糖苷酶和β-D-葡萄糖苷酶，首次证明茶叶中存在参与香气释放的β-葡萄糖苷酶。Guo et al［32］首次在茶叶中发现香气前体β-樱草糖苷。为了进一步探明香气释放相关内源酶系，Ogawa et al［30］、Guo et al［33］、Ijima et al［34］层析纯化茶鲜叶粗酶提取物，分别从不同鲜叶品种中得到了β-樱草糖苷酶。

2 β-樱草糖苷酶研究现状

β-樱草糖苷酶是水解香气前体生成相应香气成分的双糖苷水解酶。已有研究表明［33，35］，β-樱草糖苷酶对茶叶中醇系香气的释放至关重要。

2.1 β-樱草糖苷酶活性

2.1.1 专一性 β-樱草糖苷酶的专一性表现在对β-樱草糖基部分的底物特异性。Guo et al［32］研究β-樱草糖苷酶对不同底物的水解活性，发现β-樱草糖苷酶对(S)-芳樟醇-β-樱草糖苷等具有较高的活性，说明其对底物具有相对专一性。Matsumura et al［15］进一步研究β-樱草糖苷酶的专一性，以人工合成的樱草糖苷、甾菜糖苷为材料证明β-樱草糖苷酶对配糖体和糖基均具有严格特异性。Ijima et al［34］研究发现，β-樱草糖苷酶的底物专一性是对含有1 －6 糖苷键的双糖苷的相对专一性。Han et al［36］通过构建β-樱草糖苷酶3D 模型，发现仅β-樱草糖苷可与其对接的结合位点，从分子动力学角度验证了β-樱草糖苷酶的基团专一性。

2.1.2 影响β-樱草糖苷酶活性的因素 酶促反应速度受pH、温度、酶浓度、激活剂、抑制剂等多种因素影响。Guo et al［21］从粗酶中精制分离出β-樱草糖苷酶并研究其性质，认为β-樱草糖苷酶的相对分子质量约为61 ku，最适温度为45 －50 ℃，最适pH 为5 －7，稳定温度在45 ℃以下。

茶叶中糖苷酶活性还受到品种、生态环境、采摘方式、加工等因素的影响。新梢不同叶位间β-樱草糖苷酶活性表现为:芽＞第1 叶＞第2 叶＞第3 叶＞茎梗。Ogawa et al［37］研究表明，嫩叶中的β-樱草糖苷酶及其香气前体含量很高，并随着叶龄增加而降低。

2.2 β-樱草糖苷酶分子生物学研究

早期对β-樱草糖苷酶的研究集中于分离纯化、加工中变化规律以及分析不同品种间的差异性等生理生化水平。近年来，相关研究已逐步向分子水平发展。费月［38］克隆茶树β-樱草糖苷酶基因，cDNA 全长为1729 bp，ORF 框为1524 bp，编码507 个氨基酸，并将β-樱草糖苷酶的ORF 框片段插入原核表达载体中，转化至表达菌株，经过诱导后表达出融合蛋白。赵丽萍等［39］利用荧光定量实时PCR 技术，检测了龙井43 新梢的不同部位叶片中β-樱草糖苷酶和β-葡萄糖苷酶基因表达量，发现一芽一叶中β-樱草糖苷酶基因表达量很低，一芽二叶最高，而后随着叶龄增加而降低;β-葡萄糖苷酶的基因表达量远远高于β-樱草糖苷酶。张广辉［40］研究UV-B 处理对β-樱草糖苷酶和β-葡萄糖苷酶基因表达以及离体茶树叶片香气的影响，认为短时间UV-B 处理可以刺激糖苷类水解酶的基因活性，从而使更多香气前体水解并释放香气。Shi et al［41］研究表明，经过茉莉酸甲酯处理的龙井43 茶树叶片中β-樱草糖苷酶表达水平增加3 倍。

深入研究茶树的基因表达，可以进一步揭示茶叶香气形成的分子机理，利用人工手段促使糖苷酶类活性变化朝着提高茶叶品质的方向发展，为研制香型独特高长的优质茶叶产品奠定基础［42－46］。

2.3 β-樱草糖苷酶对醇系香气形成的影响

β-樱草糖苷酶是糖苷类水解关键酶，能够专一性水解β-樱草糖苷，这与醇系香气的形成紧密相关。首次发现β-樱草糖苷酶的香气前体后［32］，国内外学者通过纯化得到β-樱草糖苷酶并对其性质进行研究，从而进一步探明香气释放相关水源酶系［8，33，34］。Mizutani et al［47］研究发现，β-樱草糖苷酶可能位于细胞壁上，而香气前体在液泡中，当茶叶组织受到损伤或破坏时，酶触碰不同香气前体后释放香气。Sakata et al［22］在对乌龙茶醇系香气形成机理的研究中，分离并鉴定出了香叶醇、芳樟醇及其氧化物Ⅰ和Ⅱ、2-苯乙醇、苄醇等主要醇类香气前体，利用丙酮粉末、β-D-葡萄糖苷与柚苷酶分别与香叶醇－樱草糖苷、(S)-芳樟醇—樱草糖苷反应，发现丙酮粉末水解香叶醇—樱草糖苷、(S)-芳樟醇－樱草糖苷有较高的活性，说明除了β-葡萄糖苷酶，还有其他和茶叶醇系香气形成相关的酶。进一步的试验发现［22］，β-樱草糖苷酶对樱草糖苷的水解活性与丙酮粉末类似，而且香叶基-β-樱草糖苷的水解率明显高于香叶基-β-D-糖苷，表明β-樱草糖苷酶是使茶叶醇系香气得以释放的主要酶。

3 问题与展望

在逐渐掌握β-樱草糖苷酶酶学特性的过程中，对其底物β-樱草糖苷的研究也获得了相应成果。主要测定方法有对硝基苯酚法和甲基伞形酮法，由于底物获得难度较大，目前暂时没有明确测定β-樱草糖苷酶活性的方法，研究结果难以进行比较分析。为了进一步研究不同环境中β-樱草糖苷酶活和表达量的变化，寻找酶与香气成分之间的相关性及获得底物的方法也是研究的重点。从分子生物学角度研究β-樱草糖苷酶有利于认识其分子本质及表达调控机理，并运用于茶叶加工中。在对香气品质的调控中，通过外源添加β-樱草糖苷酶不可调控的因素较多，通过分子生物学研究茶树β-樱草糖苷酶可以有效解决这个问题，也为选育优质茶树品种奠定基础。

茶叶中糖苷类香气前体物质含量较为丰富并且难以得到标样，要对其进行定性定量比较困难。通过酶解方法得到香气物质可以提高茶叶香气品质，如何充分利用这门技术释香是今后研究的重点。基因工程技术可以有效地克服糖苷酶在应用中的局限性，因此通过基因工程手段将为醇系香气释放提供技术保障。

进一步开展糖苷酶在茶树栽培及加工过程中的变化、糖苷酶多样性及作用机理等相关研究将更好地揭示茶叶香气形成机理。而且，研究糖苷酶在茶叶加工过程中的变化规律可以丰富茶叶加工理论。另外，酶在细胞中的定位分析研究有待进一步深入，如何防止其他细胞组分的干扰，分离纯化特定细胞器，有利于酶的研究。随着对糖苷酶研究的进一步深入，发现其对茶叶深加工、食品、化工、制药等多领域具有深远的影响。利用糖苷酶提高茶饮料香气，并改善茶饮料风味。糖苷酶处理的食品也具有独特风味，预示着其在茶叶深加工和食品风味改良等方面有广阔的应用前景。

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