EPI扫描模式筛查与鉴定畜禽产品中多种抗生素残留

金 雁，李晓东，刘 瑜，蒋 施，姜玲玲，周健南，郑 晨

(1.沈阳出入境检验检疫局，沈阳 110016;2.上海爱博才思分析仪器贸易有限公司，上海 200233)

抗生素是由微生物(包括细菌、真菌、放线菌属)或高等动植物在生活过程中所产生的具有抗病原体或其他活性的一类次级代谢产物，能干扰其他生活细胞的发育功能。目前，抗生素主要用于治疗动物疾病，部分产品同时具有促进动物生长的作用。到目前为止，抗生素药物在畜禽养殖中发挥着不可替代的作用。但是，在畜禽养殖中使用抗生素药物会导致肉、蛋、奶中出现一定的残留。抗生素残留量达到一定程度时会对人体健康产生危害。我国农业部于2002年发布了《动物源性食品中兽药残留最高限量》，并适时修订。目前，国家只批准了土霉素、粘杆菌素、杆菌肽等20多种抗生素可作为饲料药物添加使用，并严格规定了使用的动物品种、生理阶段、最低用量和最高用量、使用方法、停药期和注意事项等。滥用抗生素将危及动物、动物性食品、环境甚至人类的安全，所以监控禁用或未批准的抗生素是监管部门的长期工作。

抗生素的检测方法主要有微生物分析法［1］、液相色谱法［2－5］、气相色谱质谱法［6－7］和液相色谱串联质谱法等［8－10］。其中，以液相色谱法最常见，但方法选择性差，灵敏度也达不到要求。近年来，随着液相色谱串联质谱法的普及，越来越多的实验室选择该设备用于抗生素的监控。液相色谱质谱法常用来分析一类或多种抗生素，利用保留时间和化合物的两对离子进行定性分析。但是由于抗生素种类繁多，并且在分析过程中存在假阳性的可能，所以本研究采用MRM筛查方法结合EPI谱库对比功能，对可疑色谱峰进行鉴定。该方法对保障我国食品安全具有重大的意义。

1 实验

1.1 仪器与试剂

仪器:ACQUITYTM超高效液相色谱仪(美国Waters公司);AB Sciex Qtrap 5500三重四极杆－线性加速离子阱复合质谱仪(美国AB公司);离心机(美国Thermo公司);Millipore纯水机(美国Millipore公司);MG－2200氮吹仪(美国EYELA公司);CPA 225D分析天平(德国Sartorius公司)。

试剂:双氰胺、三聚氰胺、地美硝唑、甲硝唑、克球酚、噻苯达唑、磺胺脒、奥硝唑、呋喃唑酮、特布他林、沙丁胺醇、利巴韦林、替硝唑、磺胺吡啶、磺胺嘧啶、新诺明、磺胺噻唑、喹乙醇、阿苯达唑、磺胺异噁唑、磺胺二甲基嘧啶、磺胺甲氧哒嗪、磺胺氯哒嗪、去氢睾酮、甲苯咪唑、芬苯达唑、磺胺喹恶啉、莱克多巴胺、甲睾酮、磺胺多辛、磺胺间甲基嘧啶、磺胺苯吡唑、奥芬达唑、呋喃它酮、头孢氨苄、氨苄青霉素、阿莫西林、醋酸甲孕酮、醋酸氯地孕酮、林可霉素、萘夫西林、邻氯青霉素、双氯西林标准品均购于Sigma公司。乙腈、甲醇、甲酸为色谱纯，水为超纯水。采用1%的乙酸乙腈溶液进行提取，用纳滤级聚醚枫接枝的中空纤维素膜对样品进行净化。标准品用少量乙腈溶解，色谱纯乙腈定容配制1 mg/mL标准储备液，再根据需要稀释成适当含量的标准工作液，4℃下保存，有效期为2个月。

1.2 色谱条件

Waters ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱(2.1 mm ×100 mm，粒径为 1.7 μm)，柱温为 40 ℃，进样量为5 μL，流速为0.3 mL/min。流动相A为超纯水，B相为乙腈。起始B相为5%乙腈，1～10 min B相梯度变化到40%，10～15 min B相梯度变化为95%，15～18 min B相维持95%，18～18.1 min B相梯度变化为5%，保持5 min。

1.3 质谱条件

离子源:ESI+;喷雾电压(IS):5500 V;雾化气(GS1)流量:50 mL/min;气帘气(CUR)流量:30 mL/min;辅助加热气(GS2)流量:60 L/min;离子源温度(TEM):600℃;碰撞气流量:5 mL/min，4种气体均为氮气;Q1和Q3均为单位分辨率;ESI模式、去簇电压(DP)和碰撞能(CE)见表1。

表1 化合物MRM离子对信息及参数

续表

1.4 样品前处理

取2 g样品，置于50 mL离心管中，加入4 mL水涡混5 min，向离心管中加入10 mL 1%的乙酸乙腈溶液，均质提取5 min;加入1 g氯化钠和4 g无水硫酸钠涡混振荡1 min，6000 r/min离心10 min，取5 mL乙腈相到15 mL离心管中;加入5 mL正己烷涡混30 s进行反萃取，静置1 min，弃去上层正己烷层，重复反萃取步骤1次，得到反萃取后的乙腈相;在40℃下氮吹浓缩至0.3～0.5 mL，用乙腈定容至 1 mL，过 0.22 μm 滤膜;取滤液500 μL，转移至聚醚枫接枝的中空纤维素膜组件中，4000 r/min离心8 min，收集滤液供 LC-MS/MS测定。

2 结果与讨论

2.1 化合物质谱条件优化

蠕动泵以5 μL/min的流速连续注射，分别将43种质量体积分数为0.1 μg/mL的抗生素标准溶液注入ESI离子源，在正离子模式下逐个扫描优化化合物。以莱克多巴胺为例，得到化合物的标准分子离子峰为［M+H］+302.2，优化去簇电压DP后得到最大强度的准分子离子峰。逐步加大碰撞能量CE，找到准分子离子峰最强信号强度CPS的子离子峰164.1和107.0，优化2个碎片离子峰的碰撞能量。优化的MRM离子对碰撞能和其他质谱参数见表1。按照预先优化好的色谱条件采集43种抗生素的色谱图，得到所有化合物质量体积分数为10 ng/mL的总离子流图(图1)。

图1 抗生素标准溶液的总离子流图

2.2 化合物谱库建立

在基质空白样本添加标准溶液后，控制进样质量体积分数为10 ng/mL的样本，分别设定20，35，50 eV碰撞能量的采集数据。将采集到的43种抗生素的二级质谱图添加到谱库。同样采集质量体积分数为10 ng/mL的标准溶液，分别设定20，35，50 eV的碰撞能量后，将二级质谱图添加到谱库。此外，记录化合物保留时间和MRM离子对信息建立文本库(见表1)。

2.3 化合物筛查

将前面利用保留时间和MRM离子对建立的文本库提取后整理为Excel格式存档。存档的格式可直接粘贴到操作软件上。编辑液相色谱条件，建立MRM扫描方法，采集数据。对未知样品进行筛查，在化合物浓度达到或超过检出限时采集样本，目标化合物一定会出现色谱峰。当未知样品筛查分析时出现MRM色谱峰，则认定样品为阳性可疑样品。

2.4 化合物鉴定步骤

MRM扫描方式是公认的灵敏度最高的扫描方式，在编辑方法时设定离子对信息。如果样本中含有MRM目标化合物并且高于检出限，则在总离子流图上一定会出峰，然而出峰的不一定是目标化合物。实验过程中，通过设定保留时间窗口以及MRM-IDA-EPI扫描方式采集保留时间窗口内的色谱峰。色谱峰达到IDA设定阈值条件后激发EPI，对子离子扫描谱图进行富集，实现在低浓度下子离子扫描的可能。将采集的子离子扫描谱图与本文2.2节中建立的标准谱库进行对比，软件自动给出匹配值，并且还可通过肉眼直观辨识色谱峰的纯度以及真伪，以实现化合物鉴定步骤。

上述模式对实际阳性可疑样品进行鉴定，获得MRM提取离子流图，同时采集阳性可疑样品的EPI谱图进行对比。

2.5 方法的检出限、回收率

将43种抗生素混标逐级稀释至0.5～50 ng/mL系列浓度，采集MRM数据外标法定量。结果发现:43种抗生素在0.5～50 ng/mL范围内有良好的线性关系，相关系数 r＞0.99。在 1，5，10 μg/kg 3个添加水平上，每个水平重复5次得到的平均回收率为69.3% ～102.4%，相对标准偏差为1.5%～18.3%。按照基线的3倍标准偏差计算检出限，当质量分数为0.2 μg/kg时，信噪比均大于3;当质量分数为0.5 μg/kg时，信噪比均大于10，定为定量限。

3 结束语

本研究建立了畜禽产品中43种抗生素的筛查与鉴定方法，结合实验室自建的标准谱库可对阳性可疑样品进行鉴定。实验采用MRM-IDA-EPI步骤，同时实现对43种抗生素的监控。该方法分析速度快、结果准确、灵敏度高，可满足实验室对畜禽类产品的日常检验和分析要求。

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